慢性溫和應(yīng)激加速動(dòng)脈粥樣硬化病變形成及Toll樣受體4途徑的作用研究.pdf

1、背景：動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種慢性免疫炎癥性疾病，高血脂、高血壓、肥胖等傳統(tǒng)的心血管疾病危險(xiǎn)因素只能解釋約40－50％的AS患者的患病的病理生理學(xué)機(jī)制，大約40％的沒(méi)有傳統(tǒng)的危險(xiǎn)因素的AS患者則與慢性應(yīng)激有關(guān)。雖然有越來(lái)越多的臨床流行病學(xué)研究資料表明慢性溫和應(yīng)激（chronic mild stress, CMS）在A(yíng)S性病變中有著重要作用，但對(duì)其在A(yíng)S發(fā)生與發(fā)展中的作用機(jī)制至今尚未闡明。研究表明，CMS

2、應(yīng)激還能誘發(fā)機(jī)體的慢性免疫炎癥應(yīng)答，但對(duì)其導(dǎo)致慢性炎癥發(fā)生的分子機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。鑒于通過(guò)人體研究資料來(lái)闡釋CMS在A(yíng)S性疾病發(fā)生與發(fā)展中的作用及其機(jī)制存在諸多的限制因素，因此，建立適當(dāng)?shù)腃MS動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型來(lái)探討其在A(yíng)S中的作用機(jī)制顯得尤為重要。由于apoE-/-小鼠對(duì)CMS應(yīng)激敏感性好；能自發(fā)性地發(fā)生AS病變，且其好發(fā)AS病變的部位和性質(zhì)與人類(lèi)AS極其相似，因此本研究采用CMS apoE-/-小鼠模型來(lái)研究CMS在A(yíng)S發(fā)生

3、、發(fā)展中的作用及其免疫學(xué)機(jī)制。
　　天然免疫在A(yíng)S性疾病的發(fā)生與發(fā)展、在CMS誘導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)中都有著重要作用。天然免疫通過(guò)識(shí)別被稱(chēng)為病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)的高度保守抗原域，是機(jī)體抵御微生物入侵的第一道屏障。Toll樣(Toll-like receptor，TLR)識(shí)別種類(lèi)繁多的PAMP，屬于模式識(shí)別受體。目前人類(lèi)TLR家族至少有10名成員已被發(fā)現(xiàn)。

4、TLRs與配體結(jié)合后激活NF-κB等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄（如TNF-α），進(jìn)一步激活細(xì)胞的免疫功能。實(shí)驗(yàn)提示：TLR4是連接免疫、脂質(zhì)代謝與AS的橋梁；在慢性應(yīng)激所致的免疫應(yīng)答中也可能有著重要作用。因此，本研究通過(guò)建立CMS apoE-/-AS小鼠模型來(lái)探討CMS對(duì)AS的發(fā)生與發(fā)展的影響，及其TLR4途徑在該模型小鼠AS發(fā)生、發(fā)展當(dāng)中的作用和機(jī)制。
　　目的：
　　1.慢性溫和應(yīng)激能否加速apoE-/-小鼠A

5、S的發(fā)生與發(fā)展。
　　2.慢性溫和應(yīng)激對(duì)apoE-/-小鼠主動(dòng)脈TLRs信號(hào)通路基因表達(dá)的影響。
　　3.構(gòu)建Ad-TLR4 siRNA干擾載體并轉(zhuǎn)染apoE-/-小鼠，研究TLR4 siRNA干擾對(duì)CMS apoE-/-小鼠主動(dòng)脈AS發(fā)生、發(fā)展的影響及其對(duì)主動(dòng)脈TLR4/NF-κB-MCP-1、ICAM-1、IL-1β和TNF-α基因表達(dá)的影響。
　　方法：
　　1.慢性溫和應(yīng)激apoE-/-AS小鼠模型的建立

6、及其TLRs信號(hào)通路基因表達(dá)研究
　　1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)激方案4周齡apoE-/-小鼠120只平衡一周后隨機(jī)分為2組：對(duì)照組（control組）和慢性溫和應(yīng)激組（chronic mild stress，CMS組）；每組60只。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物都以高脂、高膽固醇飼料（5％豬油，1％的膽固醇）的喂養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)所采用的應(yīng)激方案在Ipek Yalcin等建立的慢性應(yīng)激模型基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，具體應(yīng)激方案如下：墊料用水打濕17h（每周1次）；晝夜顛倒7

7、或17h（每周2次）；鼠籠傾斜成45度角7或17h（每周2次）；噪聲刺激9或15h（每周2次，80dB）；恐懼刺激1h（放入大鼠剛住過(guò)鼠籠、每周2次）。應(yīng)激試驗(yàn)組小鼠按順序接受每個(gè)應(yīng)激源的刺激。應(yīng)激組的小鼠分別在接受應(yīng)激刺激0周（n＝20），4周（n＝20），12周（n＝20）3個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物。對(duì)照組的小鼠關(guān)在單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，除了不給予應(yīng)激刺激外，其它的實(shí)驗(yàn)條件與應(yīng)激組相同。分別在試驗(yàn)開(kāi)始后的第0，4，12周3個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物。

8、r>　　1.2 糖皮質(zhì)激素濃度與蔗糖偏嗜度測(cè)定所用apoE-/-小鼠首先接受訓(xùn)練飲用1％的蔗糖水：在開(kāi)始的48h內(nèi)將蔗糖水放入鼠籠中以代替滅菌的蒸餾水，接著禁食禁水8h，通過(guò)稱(chēng)飲水瓶前后重量，連續(xù)測(cè)量3次動(dòng)物在1h內(nèi)的飲水量，計(jì)算方式如下：
　　飲用1％蔗糖水重量＝飲用前飲水瓶的重量-飲用1h后飲水瓶的重量此后每周進(jìn)行一次8h禁食禁水和1h飲蔗糖水測(cè)試。采用125I-皮質(zhì)酮放射性免疫檢測(cè)試劑盒測(cè)定血漿皮質(zhì)酮的含量，此過(guò)程貫穿于整個(gè)

9、實(shí)驗(yàn)。
　　1.3 CMS對(duì)apoE-/-小鼠主動(dòng)脈AS病變面積測(cè)定從腹主動(dòng)脈分叉至主動(dòng)脈弓將主動(dòng)脈剪下，干凈剔除主動(dòng)脈血管外的脂肪組織后，將主動(dòng)脈樹(shù)縱向剪開(kāi)，主動(dòng)脈樹(shù)以用蘇丹Ⅳ染色觀(guān)察整個(gè)主動(dòng)脈的病變。主動(dòng)脈竇連續(xù)10μm冰凍切片進(jìn)行油紅O染色，觀(guān)察主動(dòng)脈AS病變。
　　1.4 CMS對(duì)apoE-/-小鼠TLR4/NF-κB-MCP-1、ICAM-1、IL-1β和TNF-α基因表達(dá)水平的測(cè)定Real-time PCR芯片分

10、析apoE-/-小鼠主動(dòng)脈TLRs信號(hào)途徑基因表達(dá)；Western blotting方法檢測(cè)apoE-/-小鼠主動(dòng)脈TLR4和NF-κB的表達(dá)水平，免疫組化染色觀(guān)察主動(dòng)脈竇AS病變處TLR4的表達(dá)；ELISA法檢測(cè)apoE-/-小鼠血清中的MCP-1、ICAM-1、IL-1β和TNF-α表達(dá)水平。
　　2.Ad-TLR4 siRNA干擾對(duì)CMS apoE-/-小鼠主動(dòng)脈AS發(fā)生、發(fā)展及其對(duì)主動(dòng)脈TLR4/NF-κB-MCP-1、I

11、CAM-1、IL-1β和TNF-α基因表達(dá)的研究
　　2.1 Ad-TLR4 siRNA干擾載體構(gòu)建
　　2.1.1 有效封閉TLR4表達(dá)的小分子干擾RNA載體構(gòu)建設(shè)計(jì)、合成兩對(duì)特異性針對(duì)TLR4基因的小分子干擾RNA序列，分別構(gòu)建小分子干擾RNA載體 pRNAT-TLR4-1和pRNAT-TLR4-2；陰性對(duì)照為pRNAT-H1.1/Adeno空載體。DNA測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒的正確性。
　　2.1.2 有效封閉TLR4

12、表達(dá)的小分子干擾RNA載體篩選收集穩(wěn)定篩選獲得的293A-Ad-siRNA-TLR4-1、293A-Ad-siRNA-TLR4-2和293A-pNeg細(xì)胞，抽提各組細(xì)胞的總RNA和總蛋白，分別以Real time-PCR與Western blotting法檢測(cè)各組細(xì)中TLR4mRNA與蛋白的表達(dá)水平；選取對(duì)TLR4抑制率高的一對(duì)進(jìn)行體外大量擴(kuò)增。
　　2.1.3 小分子干擾腺病毒載體的體外擴(kuò)增、滴度測(cè)定以上大量擴(kuò)增獲得的Ad-si

13、RNA-TLR4-2、Ad-siRNA-Neg腺病毒以不同濃度感染293A細(xì)胞，逐孔稀釋滴度測(cè)定法檢測(cè)病毒滴度。
　　2.2 TLR4 siRNA干擾對(duì)CMS apoE-/-小鼠主動(dòng)脈AS發(fā)生、發(fā)展影響的研究4周齡雄性apoE-/-小鼠120只平衡一周后隨機(jī)分為3組：（1）CMS組；（2）CMS＋TLR4 siRNA組（10μl/只，尾靜脈注射，每5日一次）；（3）CMS＋腺病毒空載體組。每組apoE-/-小鼠40只，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物都以

14、高脂、高膽固醇飼料（5％豬油，1％的膽固醇）的喂養(yǎng)。分別在接受CMS刺激0，4，12周后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物。主動(dòng)脈竇連續(xù)10μm冰凍切片進(jìn)行油紅O染色，觀(guān)察主動(dòng)脈AS病變。
　　2.3 TLR4 siRNA干擾對(duì) CNS apoE-/- TLR4/NF-κB-MCP-1、ICAM-1、IL-1β和TNF-α基因表達(dá)水平的測(cè)定分別以Real-time PCR方法檢測(cè)apoE-/-小鼠主動(dòng)脈TLR4和NF-κB mRNA表達(dá)水平；以W

15、estern blotting方法檢測(cè)其主動(dòng)脈TLR4和NF-κB蛋白質(zhì)表達(dá)水平；ELISA法檢測(cè)apoE-/-小鼠血清中的MCP-1、ICAM-1、IL-1β和TNF-α表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.CMS顯著升高apoE-/-小鼠血漿糖皮質(zhì)激素水平結(jié)果顯示：對(duì)照組小鼠血漿中皮質(zhì)酮的濃度小于100ng/ml；CMS組apoE-/-小鼠應(yīng)激4周后，CMS組小鼠血漿中的皮質(zhì)酮激素的水平顯著高于正常對(duì)照組；而應(yīng)激12周后，CM

16、S組小鼠血漿皮質(zhì)酮激素濃度大約是對(duì)照組的11倍，與相應(yīng)對(duì)照組相比，其血漿皮質(zhì)酮激素濃度差異有非常顯著（457.3±56.5 ng/ml vs40.2±7.2 ng/ml，P<0.001）。
　　2.CMS顯著降低apoE-/-小鼠1%蔗糖水溶液攝取量結(jié)果表明：基線(xiàn)測(cè)試中應(yīng)激組與對(duì)照組apoE-/-小鼠1％蔗糖水的飲用量沒(méi)有差異（P>0.05）。在整個(gè)的實(shí)驗(yàn)時(shí)期內(nèi)（12周），對(duì)照組小鼠的攝取蔗糖量沒(méi)用明顯的改變；而隨著應(yīng)激時(shí)間的增加

17、，CMS組小鼠1％蔗糖水的飲用量逐漸顯著減少。方差分析表明，CMS對(duì)apoE-/-小鼠1％蔗糖水的飲用量的改變有著顯著作用[F(1,456)=236.47, P<0.01]。Two-Way ANOVN方差分析表明，隨著應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)，CMS對(duì)apoE-/-小鼠1％蔗糖水的飲用量明顯存在著應(yīng)激×?xí)r間的交互作用[F(12,456)=141.42, P<0.001]。
　　3.CMS顯著加速apoE-/-小鼠主動(dòng)脈樹(shù)AS病變的發(fā)生與發(fā)展

18、研究結(jié)果表明：0周時(shí)，應(yīng)激組與對(duì)照組的小鼠主動(dòng)脈都未發(fā)生AS病變；接受4周、12周CMS刺激后的apoE-/-小鼠主動(dòng)脈AS病變的面積占整個(gè)主動(dòng)脈樹(shù)面積的百分比分別為10.37％±2.32％和24.58％±3.81％，而相應(yīng)對(duì)照組小鼠主動(dòng)脈AS病變的面積占整個(gè)主動(dòng)脈樹(shù)面積的百分比分別為2.61％±0.57％和6.36％±1.47％；應(yīng)激組主動(dòng)脈的AS病變與相應(yīng)對(duì)照組相比，差異顯著（P<0.01）。
　　4.CMS顯著加速apoE-

19、/-小鼠主動(dòng)脈竇AS病變的發(fā)生與發(fā)展結(jié)果表明：在實(shí)驗(yàn)剛開(kāi)始時(shí)（0周），應(yīng)激組與對(duì)照組apoE-/-小鼠主動(dòng)脈竇都未發(fā)生AS病變；而經(jīng)過(guò)4、12周的高脂、高膽固醇的飲食喂養(yǎng)后，對(duì)照組與應(yīng)激組apoE-/-小鼠的主動(dòng)脈竇都出現(xiàn)AS病變，隨著時(shí)間的增加，主動(dòng)脈竇AS病變顯著加重。apoE-/-小鼠接受4、12周CMS刺激后，其主動(dòng)脈竇AS病變與相應(yīng)對(duì)照組相比較，應(yīng)激組的AS病變顯著加重。CMS應(yīng)激12周apoE-/-小鼠主動(dòng)脈竇的AS病變的面

20、積為0.24±0.03 mm2，而相應(yīng)對(duì)照組apoE-/-小鼠主動(dòng)脈竇的AS病變面積僅為0.05±0.01 mm2。二者AS病變面積相比較，有顯著差異（P<0.01）。
　　5.CMS對(duì)apoE-/-小鼠主動(dòng)脈TLRs信號(hào)途徑基因表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在TLR蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)Real-time PCR芯片檢測(cè)的83個(gè)基因當(dāng)中，與對(duì)照組相比較，應(yīng)激組當(dāng)中apoE-/-小鼠主動(dòng)脈的TLRs信號(hào)轉(zhuǎn)到途徑中的43個(gè)基因發(fā)生了顯著性的改變，二

21、者相比差異顯著，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；其中15表現(xiàn)為上調(diào)，28個(gè)表現(xiàn)下調(diào)。在共9個(gè)TLR樣受體基因表達(dá)中，與相應(yīng)對(duì)照組相比較，應(yīng)激組的TLR4基因表達(dá)增加4倍多，而其它8個(gè)TLR樣基因表達(dá)減少或不變，這說(shuō)明CMS對(duì)apoE-/-小鼠主動(dòng)脈TLRs的基因表達(dá)有差異。CMS誘導(dǎo)的TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活后的基因表達(dá)中，IL-1β、TNF-α和IL-6的表達(dá)顯著增加；其中IL-1β的表達(dá)增加了10倍多，與對(duì)照組相比，差異顯著（P＝0.008）。<

22、br>　　6.CMS對(duì)apoE-/-小鼠主動(dòng)脈TLR4蛋白表達(dá)的影響0周時(shí)，對(duì)照組與CMS應(yīng)激組apoE-/-小鼠的主動(dòng)脈TLR4蛋白表達(dá)都比較少（0.21±0.03 vs0.22±0.05），對(duì)照組與應(yīng)激組apoE-/-小鼠主動(dòng)脈TLR4蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。給予4周CMS刺激后，對(duì)照組與應(yīng)激組apoE-/-小鼠主動(dòng)脈TLR4蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.25±0.08 vs0.74±0.06，P<0.05）。12