瞬時感受器電位M7通道在RBL-2H3細胞的表達及功能研究.pdf

1、支氣管哮喘是一種由多種因素引起的，以可逆性氣道阻塞、氣道高反應性和氣道炎癥為特征的變態(tài)反應性疾病。目前全世界約有3億哮喘患者，患病率大約以每年1％的速度遞增，尤其以兒童哮喘的患病率上升顯著。現(xiàn)有的治療方案包括糖皮質(zhì)激素、支氣管擴張劑、白三烯調(diào)節(jié)劑等并不能滿足部分哮喘患者的治療需求，每年死于哮喘病的患者有18萬之多，而且近期哮喘的死亡率在世界范圍內(nèi)均呈直線上升。哮喘的發(fā)病機制非常復雜，目前的觀點認為IgE介導的肥大細胞被激活所致的Ⅰ型超敏

2、反應是哮喘發(fā)病的重要因素。機體在暴露于抗原后，樹突狀細胞與CD4+T細胞相互作用并導致Th2型細胞因子的產(chǎn)生，促使B細胞生成IgE并通過肥大細胞表面與IgE抗體Fc段呈高親和力的受體(FcεRI)結(jié)合，使機體處于對該抗原的致敏狀態(tài)。當相應抗原再次進入機體時通過與致敏肥大細胞表面兩個或兩個以上相鄰IgE抗體特異性結(jié)合，使膜表面FcεRI交聯(lián)活化并最終導致肥大細胞脫顆粒并導致后續(xù)的炎癥反應。目前認為β-氨基已糖苷酶是監(jiān)測肥大細胞脫顆粒釋放的

3、標志。
　　 鈣離子在肥大細胞活化后的脫顆粒反應起重要作用。當FcεRI受體激活后，細胞內(nèi)鈣離子濃度呈雙相升高，最初的短暫的鈣離子濃度升高目前機制已較明確，主要通過生成三磷酸肌醇使存儲在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Ca2+釋出，升高胞漿Ca2+水平。但這個過程鈣離子濃度呈一過性的升高，是一個瞬時變化，并不能滿足細胞的持久反應，隨后持續(xù)的胞內(nèi)鈣離子濃度升高才是肥大細胞參與病理生理活動的關鍵。但是，究竟哪些離子通道介導了鈣離子內(nèi)流目前尚未完全明確。

4、r>　　 興奮性細胞的鈣離子內(nèi)流主要依靠電壓操縱性鈣通道。但是作為非興奮性細胞，肥大細胞缺乏電壓操縱性鈣通道。瞬時感受器電位通道(TRP)為鈣庫操控性鈣離子內(nèi)流(SOCE)通道，包括7個亞家族，其中TRPM亞家族含有8個成員(TrM1-TRPM8)，因其作為與鈣離子轉(zhuǎn)運有關系的通道一直為學者們所關注。瞬時感受器電位M7(TRPM7)是TRPM的重要成員之一，有研究表明它可介導鈣離子和鎂離子內(nèi)流，消除DT-40 B淋巴細胞的TRPM7立

5、即引起細胞成長停止和死亡，顯示TRPM7引起的鈣流入對該細胞的存活起關鍵作用；最近的研究表明TRPM7在人類肥大細胞上有表達并對肥大細胞存活有重要作用。因此，TRPM7有可能是肥大細胞上一個重要的介導鈣離子內(nèi)流的通道。
　　 因此，本研究選擇大鼠RBL-2H3細胞作為研究對象，首先檢測RBL-2H3細胞TRPM7通道的表達及表達部位，然后再構建TRPM7-siRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，通過TRP通道阻斷劑2-APB抑制TRPM7功能

6、及逆轉(zhuǎn)錄病毒介導的RNA干擾下調(diào)TRPM7表達，觀察TRPM7通道在RBL-2H3細胞的存活、凋亡以及抗原活化中的作用，初步研究RBL-2H3細胞TRPM7的功能，為揭示TRPM7通道參與肥大細胞病理生理活動提供堅實的研究基礎。
　　 第一章瞬時感受器電位M7通道在RBL-2H3細胞的表達
　　 研究目的：
　　 明確TRPM7通道在RBL-2H3細胞的表達情況。
　　 研究方法：
　　 RT-P

7、CR檢測RBL-2H3細胞TRPM家族mRNA的表達；Western blot檢測RBL-2H3細胞TRPM7蛋白的表達；細胞免疫熒光檢測TRPM7通道在RBL-2H3的表達部位。
　　 結(jié)論：
　　 TRPM7通道表達于在RBL-2H3細胞并主要位于細胞膜。
　　 第二章TRPM7-siRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構建
　　 研究目的：
　　 構建攜帶大鼠TRPM7-siRNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。

8、>　　 研究方法：
　　 設計3個TRPM7-siRNA序列和1個無關對照序列，克隆到酶切的pSuper-retro-neo-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。重組質(zhì)粒采用脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染RBL-2H3細胞，通過Western blot檢測干擾效率。篩選出最有效的pSuper-retro-neo-GFP-siTRMP7與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細胞生成逆轉(zhuǎn)錄病毒；逆轉(zhuǎn)錄病毒感染RBL-2H3細胞，熒光實時定量P

9、CR及Western blot檢測TRPM7-siRNA的沉默效果。
　　 結(jié)論：
　　 成功構建大鼠TRPM7-siRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，為研究TRPM7的功能提供了有力的工具。
　　 第三章瞬時感受器電位M7通道在RBL-2H3細胞的功能研究
　　 研究目的：
　　 明確TRPM7通道在RBL-2H3細胞存活、凋亡及抗原活化的作用。
　　 研究方法：
　　 1、以TRP通道阻斷

10、劑2-APB抑制TRPM7功能及TRPM7-siRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染RBL-2H3細胞，通過MTT、流式細胞術以及TUNEL-FITC/Hoechst33258檢測比較不同處理后RBL-2H3細胞數(shù)及凋亡率的變化及差異，觀察TRPM7通道在RBL-2H3細胞存活及凋亡的作用；
　　 2、以DNP-IgE致敏過夜后再用抗原DNP-BSA激活RBL-2H3細胞，測定β-氨基已糖苷酶的含量及細胞內(nèi)鈣離子濃度變化；以TRP通道阻斷劑