hβ2亞基在BK通道孔中的作用位點探測及TRPV1通道的脫敏機制研究.pdf

1、現(xiàn)代生命科學的發(fā)展改變著人們對生命獲得過程的認識，而離子通道的研究不僅與信號發(fā)生、傳遞和轉(zhuǎn)導緊密關聯(lián)，同時也涉及到誘發(fā)各種遺傳或非遺傳疾病的分子機制。了解離子通道的精細結構，探討離子通道的門控機制和動力學特性，弄清楚離子通道結構和功能之間的關系意義重大。本研究工作由兩部分組成：第一部分探討了鈣和電壓激活的大電導鉀離子通道（Maxik 通道，又名BK 通道）的β2 亞基N 端失活域在由α亞基組成的孔道中的作用位點；文章第二部分則是講述痛覺

2、敏感型通道TRPV1的適應性調(diào)節(jié)的分子機制的。
　　 BK 通道廣泛地存在于可興奮細胞，特別是神經(jīng)系統(tǒng)中，具有調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣濃度和膜電位等重要生理功能。目前，電壓依賴型鉀離子通道（Kv 通道）的研究已取得較大進展。BK通道與Kv通道在結構和功能上既存在某些相似之處又各具特點。如它們都結合有β輔助亞基，并由β亞基的N端疏水性氨基酸殘基堵塞孔道引起N型失活。
　　 然而現(xiàn)有實驗結果表明，K+通道的孔道阻斷劑（如TEA、QX-31

3、4等）能夠減慢Kv通道的失活過程，然而卻不能減慢BK 通道的失活。為什么這兩者如此不同？BK通道的β2亞基N端失活域是否進入由α亞基組成的BK孔道？兩者究竟發(fā)生了怎樣的相互作用？通道阻斷劑為什么不和失活域在通道孔中相互競爭結合位點？本課題的研究目的之一即是要回答和解決這些目前仍然困擾我們的問題。我們將hβ2N端的前三個氨基酸FIW突變?yōu)镕WI，發(fā)現(xiàn)hβ2的這一突變體hβ2-FWI對BK通道的失活沒有影響，但通道的失活恢復曲線卻由單指數(shù)轉(zhuǎn)

4、變?yōu)殡p指數(shù)。利用hβ2-FWI所引起的雙指數(shù)恢復特性變化作為兩者間相互作用的判定依據(jù)。通過丙氨酸掃描法(Alaninescanning)，即將α亞基形成孔道的S6區(qū)疏水性氨基酸依次突變?yōu)槭杷暂^弱的丙氨酸，然后通過膜片鉗實驗記錄分析失活后通道的恢復特性變化，進而了解兩者間的相互作用。
　　 借助作為通道孔道阻滯劑的麻醉劑QX-314和TEA等藥物進一步解釋了BK通道失活的非競爭機制。我們得到了如下幾個結論：
　　 (1)

5、位于mSlo1孔道中的氨基酸Ile-323是失活過程中與β2亞基N端失活域有相互作用的主要位點。孔道內(nèi)的另外兩個氨基酸M314和V319 也參與了這一過程。
　　 根據(jù)hβ2-FWI 亞基N 末端的線性結構特點，我們推測mSlo1孔道與hβ2-FWI在BK通道失活過程中存在如下的相互作用關系：I323-I，V319-W，M314-F，其中I323起著主導性的作用。同時進一步明確了β2亞基的失活域的確進入了BK通道的孔道從而引起通

6、道的失活。
　　 (2)通道阻滯劑QX-314和TEA在BK孔道內(nèi)均無特異性的結合位點。因此它們不會像其它胞內(nèi)阻斷劑那樣在抑制Kv 通道電流的同時還減慢通道的失活，這是因為β2 N 端失活域的作用位置比較靠近孔道口，即孔道內(nèi)的最后一個疏水性氨基酸Ile-323，而QX-314的作用位置位于孔道內(nèi)，因此QX-314不會與失活域競爭相同的作用位點，從而不會影響β2 引起的通道失活過程。根據(jù)實驗結果，我們提出了一個全新的非競爭模型，該

7、模型不僅可以很好的解釋我們的數(shù)據(jù)，而且為進一步闡釋BK通道的結構和門控機制提供了重要的實驗和理論支持。
　　 (3)我們的實驗結果還顯示：與野生型mslo1 通道電流相比，突變型I323A不管是單通道還是宏觀電流均有明顯差異，表現(xiàn)為出現(xiàn)了野生型通道所不具有的外向整流特性。形式上突變型I323A的單通道出現(xiàn)了非常像噪聲的電流，同一電壓下可以同時記錄得到幾個不同大小的單通道電流，即是說Ile-323A 還引起了BK 通道電導的改變。

8、據(jù)此我們推測Ile-323對BK 通道具有雙重作用，既是β2 失活域在孔道中的作用位點，同時還能調(diào)節(jié)BK 通道的門控特性。另外還發(fā)現(xiàn)一個非常有趣的現(xiàn)象，312位點的Leu 亮氨酸殘基的突變能夠極大地改變BK 通道的電壓依賴性。我們研究小組在后續(xù)的兩篇文章中分別證明了這兩點推測：Ile-323 確實為BK 通道的關節(jié)所在，323 點的氨基酸殘基疏水性降低，會使得“關節(jié)”變得松弛，進而導致通道開放時四個亞基間協(xié)同性的不一致和開放幾率的改變(

9、Guo et al，Biophys J. 2008 May 1;
　　 94(9):3714-25)。而Leu312位點則可以極大地增強BK 通道的電壓敏感性（Wu et al.,J Biol Chem. 2009 Aug 28；284(35):23353-63）。
　　 適應性調(diào)節(jié)是大部分感覺器官共有的一種性質(zhì)，但是痛覺適應性產(chǎn)生的根源和機理仍然不為人們所知。文章的第二部分在受體水平探討了傷害感受器TRPV1 通道的適

10、應性調(diào)節(jié)的分子機制。我們發(fā)現(xiàn)通道在脫敏反應發(fā)生后，僅改變了通道對激動劑的敏感性，而不影響最大電流的響應，據(jù)此，我們在脫敏感念的基礎上提出了痛覺適應性調(diào)節(jié)概念。該部分我們主要得到以下幾個主要結論：
　　 (1)Ca2+經(jīng)由開放的TRPV1 通道內(nèi)流引起脫敏反應的發(fā)生，脫敏反應發(fā)生后僅改變了通道對辣椒素的敏感性，濃度敏感性降低了14 倍，但這一改變并不影響通道的功能。
　　 (2)通過聯(lián)合應用全內(nèi)反射熒光顯微技術和膜片鉗記錄

11、技術，我們證實了PIP2參與了TRPV1 通道脫敏反應的發(fā)生，PIP2 分解的速率和量的變化都足以改變通道對激動劑的響應。借助藥物Rapamycin 專一性降低細胞內(nèi)PIP2含量作為研究工具，通過測量通道對辣椒素濃度依賴性曲線，我們進一步量化了PIP2對脫敏反應的貢獻，約占60%。
　　 (3)我們還發(fā)現(xiàn)TRPV1 通道對激動劑敏感性的改變依賴于刺激強度，不同的刺激強度得到不同程度的脫敏響應。我們推測有兩種可能性：一是通道蛋白有