BK通道α與β2亞基結合位點以及KCNE2調節(jié)KCNQ1通道上膜機制的研究.pdf

1、離子通道是成孔的膜蛋白，它們不僅可以通過門控進出細胞的離子來調節(jié)細胞的電活動，還可以調節(jié)上皮細胞的離子流動，甚至對維持細胞的體積都有重要作用。鉀離子通道是分布最廣泛的一類離子通道，它們調節(jié)細胞的多種生理功能。BK和KCNQ1通道是兩種非常重要的鉀離子通道，也是我們研究的重點。本文的主要內容圍繞以上兩種鉀離子通道可以分為以下兩個部分：
　　1）BK通道α和β2亞基結合位點的研究
　　大電導的、Ca2+和電壓激活的鉀離子通道（B

2、K通道），作為膜電位和胞內 Ca2+濃度的雙重感受器，在興奮細胞中調節(jié)多種電活動，并調節(jié)神經(jīng)遞質的釋放。在BK通道的輔助亞基中，β2亞基不僅增強了通道對Ca2+的敏感性，而且使通道發(fā)生失活。另外，已有證據(jù)證明在BK(β2)通道失活的過程中，在開放態(tài)（O）和失活態(tài)（I）之間存在一個非常短暫的電導狀態(tài)，稱為預失活態(tài)（O*）。對BK通道α和β2亞基相互作用的研究一直不斷，但是兩個亞基之間具體的結合位點一直不知道，預失活態(tài)產(chǎn)生的結構基礎也一直未

3、知。
　　在研究中，我們發(fā)現(xiàn)β2的一個突變體dFIW-hβ2，可以抑制BK通道α亞基mSlo1在細胞膜上的表達，并將其滯留胞內。利用dFIW-hβ2這一特性，我們開發(fā)了一種新的方法來研究mSlo1和hβ2亞基之間的結合位點，即在mSlo1和dFIW-hβ2上構建一系列突變，通過定量免疫熒光技術測量 mSlo1在細胞膜上表達水平的變化來鑒定兩者的結合位點。最終我們在mSlo1的胞內C端和hβ2的胞內N端部分發(fā)現(xiàn)了兩對互補的結合位點，

4、即 mSlo1(K392/R393)::hβ2(E44/D45)和 mSlo1(K330/K331)::hβ2(D16/E17)，并用“雙突變循環(huán)法”做了進一步驗證。另外，利用一個證明 BK(hβ2)通道存在預失活態(tài)的突變體 hβ2(W4E)，我們證明 mSlo1(K330/K331)::hβ2(D16/E17)這一對互補的結合位點即為通道預失活態(tài)存在的結構基礎。最后，基于BK(mSlo1α) C端的晶體結構，我們重建了BK(hβ2)通

5、道復合體的結構模型，該模型展示了兩對互補結合位點可能的作用方式，并為BK通道α與β2亞基之間相互作用的研究提供了重要線索。
　　2）KCNE2調節(jié)KCNQ1通道上膜機制的研究
　　電壓門控的KCNQ1通道在調節(jié)心肌細胞的興奮性中發(fā)揮重要的作用，KCNQ1基因突變會引發(fā)長 QT綜合征，導致嚴重的心律不齊、室顫和心臟休克。輔助亞基KCNE2與KCNQ1的結合會使KCNQ1通道從一個延遲整流的鉀離子通道變成一個類似背景的鉀離子漏通

6、道。已有報道稱KCNE2會降低KCNQ1通道的電流振幅和電流密度，但是具體的原因和機制一直未知曉。
　　本文發(fā)現(xiàn) KCNE2降低 KCNQ1通道電流振幅和電流密度的原因是其抑制了KCNQ1通道在細胞膜上的表達，并將其滯留在內質網(wǎng)中。通過構建KCNE1/KCNE2的嵌合體，并用定量免疫熒光成像技術和電生理技術分別統(tǒng)計了它們在細胞膜上的表達量和電流密度，發(fā)現(xiàn)KCNE2的N端是抑制KCNQ1在細胞膜上表達的主要原因。為了進一步探索 KC

7、NE2 N端抑制 KCNQ1通道在細胞膜上表達的機制，我們在KCNE2的N端構建了一系列的突變和truncation，并將其與KCNQ1共表達。發(fā)現(xiàn)將KCNE2 N端的兩種突變體，即去掉疏水氨基酸或者切掉25–29氨基酸片段，與KCNQ1共表達時，KCNQ1的上膜表達水平都有了一定程度的恢復。當將疏水氨基酸和25–29氨基酸片段同時去掉時，KCNQ1的上膜表達量幾乎完全恢復。以上結果說明KCNE2調節(jié)KCNQ1通道的上膜表達很可能是通過