血管緊張素Ⅱ?qū)CNQ1-KCNE1鉀通道蛋白表達的調(diào)節(jié).pdf

1、延遲整流鉀電流IK是人和哺乳動物的心室肌細胞動作電位主要的復極外化向鉀電流，其中包括兩種電流成分：慢激活(Slow delayed rectifierpotassium current，IKs)和快激活(Rapid delayed rectifier potassiumcurrent，IKr)。目前認為KCNQ1編碼的α亞單位和KCNE1編碼的β亞單位共同構(gòu)成IKs鉀通道。KCNQ1屬于Kv鉀通道家族KCNQ成員之一(KCNQ1-5或K

2、v7.1-7.5)。KCNQ1異源表達能產(chǎn)生快激活、慢失活的外向電流。迄今發(fā)現(xiàn)的五種KCNE蛋白都能夠?qū)CNQ1通道功能起不同的調(diào)節(jié)作用，其中KCNQ1/KCNE1異源表達形成慢激活、慢去激活、無失活的電流，其電流動力學特征和藥理學特征與心臟的IKs通道很相似。
　　業(yè)已證明，KCNQ1及KCNE1基因突變是引發(fā)離子通道病的分子遺傳基礎，包括通道功能下調(diào)相關(guān)的長QT綜合征(LQT1、LQT5)或功能上調(diào)引發(fā)的短QT綜合征(SQT

3、2)。同時，越來越多的證據(jù)顯示，許多心血管疾病狀態(tài)下，如心肌肥厚，心衰等伴有IKs通道功能的下調(diào)，是獲得性LQT產(chǎn)生的重要原因之一。無論是復極延遲的LQT或是復極縮短的SQT，都可能導致心律失常，特別是尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動過速，是高發(fā)心源性猝死的危險。因此研究IKs通道功能調(diào)節(jié)具有重要的意義。
　　腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)在調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)的正常生理功能以及高血壓、心肌肥大、充血

4、性心力衰竭等諸多心血管的病理過程中具有重要作用。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是其該系統(tǒng)的主要體液因子，近年的研究表明AngⅡ?qū)π募‰x子通道功能具有直接調(diào)控作用。在先前我們的試驗中，發(fā)現(xiàn)AngⅡ通過激活AT1受體對豚鼠心室肌細胞上IKs呈急性下調(diào)，已知AT1受體激動產(chǎn)生的效應包括急性作用(發(fā)生在幾分鐘內(nèi))和慢性作用，后者常常為基因轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。然而AngⅡ?qū)Ks通道的慢性調(diào)控作用尚不清楚。本研究用分子生物學、免疫熒光顯微鏡等實驗技術(shù)，在

5、異源表達體人胚胎腎細胞(HEK293)上共表達人的KCNQ1、KCNE1以及人AT1受體cDNA，24h后，觀察AngⅡ?qū)CNQ1/KCNE1通道慢性調(diào)控作用，并分析了細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導通路
　　第一部分AngⅡ?qū)CNQ1通道蛋白表達的影響
　　目的：觀察不同濃度及不同時間AngⅡ?qū)CNQ1通道蛋白表達的影響。
　　方法：在HEK293細胞上運用Lipofectin2000轉(zhuǎn)染試劑瞬時共轉(zhuǎn)染帶標簽的V5-KCNQ1

6、或Myc-KCNQ1、KCNE1及人AT1受體cDNA，24h后，運用特異性抗標簽抗體，western blot技術(shù)檢測AngⅡ在不同濃度、不同時間對KCNQ1通道蛋白表達的影響。運用免疫熒光共聚焦顯微鏡技術(shù)觀察AngⅡ?qū)毎ど贤ǖ赖鞍妆磉_的影響。
　　結(jié)果：(1)AngⅡ與細胞孵育24h可明顯降低KCNQ1蛋白含量，AngⅡ在10、100、1000 nM濃度下蛋白含量分別是對照的80％、68％、67％，；(2)AngⅡ(100

7、 nM)不同時間(2、6、12、24h)孵育后通道蛋白的下調(diào)出現(xiàn)在12小時；(3)免疫熒光實驗進一步證實，給予AngⅡ(100nM)24h后，細胞膜上的通道蛋白熒光強度明顯減弱。
　　結(jié)論：在異源表達系統(tǒng)，長時間孵育AngⅡ能夠引起KCNQ1通道蛋白的表達量下降。
　　第二部分 PKC信號通路對AngⅡ作用的影響
　　目的：異源表達細胞線上分析AngⅡ?qū)CNQ1通道慢性調(diào)控作用的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路。
　　方法：

8、采用脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染方法，在HEK293細胞共轉(zhuǎn)染帶標簽的V5-KCNQ1、KCNE1及人AT1受體cDNA24h后，運用特異性抗標簽抗體，western blot技術(shù)檢測觀察使用PKC抑制劑或激動劑對AngⅡ下調(diào)KCNQ1通道蛋白表達的影響。
　　結(jié)果：(1)PKC抑制劑Bis-1(100nM)與細胞孵育30min后再加入AngⅡ(100nM)共同作用24h，與單獨孵育AngⅡ相比通道蛋白表達含量出現(xiàn)了明顯增加現(xiàn)象，說明Bis-1

9、可拮抗AngⅡ的作用；(2)PKC激動劑PMA(100nM)細胞孵育30min后再加入AngⅡ(100nM)共同作用24h，與單獨孵育AngⅡ相比通道蛋白表達量亦明顯增加，其蛋白含量為對照組的97％，表明長時間孵育PMA使PKC耗竭后可拮抗AngⅡ的作用；(3)單用PKC激動劑PMA分別作用細胞30min及24h，PMA作用30min的蛋白含量為對照相的49％，而24h蛋白的表達含量為對照組的95％；PKC激動劑OAG孵育30min及2

10、4h后，通道蛋白表達量分別為對照的46％和40％，表明直接激動PKC下調(diào)通道蛋白表達，PMA具較強的PKC激活作用，長時間孵育導致PKC耗竭后其下調(diào)作用消失。
　　結(jié)論：AngⅡ通過激動AT1受體、激活PKC信號通路而下調(diào)KCNQ1通道蛋白。
　　第三部分 KCNE1-S102突變對AngⅡ作用的影響
　　目的：因近期有研究顯示，PKC可通過KCNE1上S102磷酸化加速通道蛋白入胞降解，本實驗觀察在AngⅡ?qū)ν蛔兺ǖ?/p>

11、KCNQ1/KCNE1-S102A的作用，分析AngⅡ調(diào)節(jié)通道蛋白的可能機制。
　　方法：采用脂質(zhì)體介導瞬時轉(zhuǎn)染方法，在HEK293細胞共轉(zhuǎn)染帶標簽的V5-KCNQ1、KCNE1、KCNE1-S102A及人AT1受體cDNA24h后，運用特異性抗標簽抗體，應用western blot技術(shù)檢測KCNQ1蛋白含量，比較AngⅡ?qū)CNQ1/KCNE1、KCNQ1/KCNE1-S102A通道作用的差別。
　　結(jié)果：共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-KC