BK通道的動(dòng)態(tài)鈣離子敏感性以及α-β亞基間相互作用機(jī)制的研究.pdf

1、BK通道是一種鉀離子通道，因具有最大的單通道電導(dǎo)（約300pS）而得名，可以同時(shí)響應(yīng)跨膜電壓及胞內(nèi)鈣離子濃度兩種信號(hào)。BK通道由α功能亞基（Slo1）和β輔助亞基組成。α亞基形成了通道的主要功能結(jié)構(gòu)，它含有7次跨膜域S0-S6以及一個(gè)較大的C端RCK結(jié)構(gòu)，其上含有的D362,D367和Ca2+bowl兩個(gè)鈣離子結(jié)合位點(diǎn)。β亞基有四個(gè)（β1、β2、β3、β4），它們均由兩段跨膜區(qū)TM1-2支撐著一個(gè)較大的胞外loop區(qū)，N端和C端都位于胞

2、內(nèi)。BK通道的α功能亞基在人體大部分組織中都具有表達(dá)，再加上輔助亞基在不同組織中的特異表達(dá)便形成了BK通道在不同組織中的不同功能，如參與神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、血管平滑肌收縮、神經(jīng)沖動(dòng)的超極化等。
　　BK通道的動(dòng)態(tài)鈣敏感性以及α功能亞基和β輔助亞基間相互作用機(jī)制的研究一直在進(jìn)行，但由于技術(shù)或方法的限制，使其多年來一直是BK通道領(lǐng)域內(nèi)難以徹查的迷題。而深入研究BK通道這些特性對(duì)其參與的眾多生理活動(dòng)的調(diào)節(jié)的理解以及BK通道相關(guān)的疾病機(jī)理研究

3、乃至治療都意義深遠(yuǎn)。
　　本文的研究工作主要包括對(duì)BK通道相關(guān)的兩個(gè)問題的研究：
　　第一部分，結(jié)合傳統(tǒng)的膜片鉗技術(shù)與光解鈣釋放技術(shù)研究了BK通道對(duì)快速變化的鈣信號(hào)的響應(yīng)以及通道的鈣結(jié)合時(shí)間物理常數(shù)。在對(duì)BK通道的研究中通常會(huì)先恒定胞內(nèi)/通道內(nèi)側(cè)的鈣濃度，更多的在電壓上面做文章來研究通道的相關(guān)特性，但實(shí)際生理活動(dòng)中的鈣信號(hào)通常都是實(shí)時(shí)變化的，BK通道本身對(duì)動(dòng)態(tài)鈣信號(hào)的響應(yīng)就是一個(gè)值得深究的問題。同時(shí)，科學(xué)研究中對(duì)生理活動(dòng)中鈣

4、信號(hào)的監(jiān)測(cè)主要依賴熒光的方法來得到整個(gè)胞內(nèi)global的鈣信號(hào)的“平均”，而精確觸發(fā)、調(diào)節(jié)某些生理活動(dòng)事實(shí)上更依賴于膜上的local鈣濃度，這個(gè)重要的生理參數(shù)多年來一直沒有很好的方法來測(cè)量。在這一部分的研究中，主要研究結(jié)果和結(jié)論如下：
　?。?）利用光解鈣釋放過程中亞毫秒級(jí)的鈣信號(hào)變化研究了BK通道對(duì)快速變化的鈣信號(hào)的響應(yīng)，確定了BK通道的鈣結(jié)合時(shí)間常數(shù)為1.8*108M-1s-1。結(jié)果同時(shí)表明BK通道對(duì)鈣信號(hào)的變化有著超快的響應(yīng)

5、，可以無延時(shí)的跟隨亞毫秒級(jí)的鈣信號(hào)變化。
　　（2）隨后根據(jù)BK通道可無延時(shí)的跟隨鈣信號(hào)變化的特性，將BK通道作為鈣探測(cè)器測(cè)量了仿動(dòng)作電位中的local鈣濃度的變化：在動(dòng)作電位的上升期及下降前期，該local鈣濃度持續(xù)上升至≥20μM，然后伴隨動(dòng)作電位的下降相而下降并大約穩(wěn)定在4μM。
　　（3）檢測(cè)了一個(gè)跟癲癇相關(guān)的BK通道突變體D369G對(duì)來自Cav1.2鈣通道的變化鈣信號(hào)的響應(yīng)，證明該突變體通道不僅在穩(wěn)態(tài)鈣濃度下比野生

6、型BK通道具有更高的鈣敏感性，而且對(duì)變化的鈣信號(hào)也具有更快的響應(yīng)，為更好的理解BK通道引起的癲癇提供了新的思路。
　　第二部分綜合運(yùn)用了雙循環(huán)法、整流檢驗(yàn)法、免疫熒光駐留法以及結(jié)構(gòu)生物學(xué)，主要研究了帶β2輔助亞基的（mSlo1/β2型）BK通道功能亞基α與輔助亞基β2間的相互作用。由β亞基在不同組織中的特異表達(dá)也會(huì)產(chǎn)生BK通道在不同組織中的不同功能，而BK通道亞基間的相互作用機(jī)制的闡明是理解BK通道在這些功能中的理論基礎(chǔ)，但是目前

7、仍然沒有BK通道復(fù)合體Slo1/βx的結(jié)構(gòu)，加上精確研究通道蛋白間相互作用的方法的限制，該問題多年來一直沒有得到很好的解答。在此部分的研究中，主要研究結(jié)果和結(jié)論如下：
　?。?）確定了BK(β2)通道的預(yù)失活作用點(diǎn)PI site(Pre-inactivation site)以及通道的失活機(jī)制模型：C←→O←→O*←→I，即通道在失活前，β2的N端失活臂上的β2(E16,D17)位兩個(gè)負(fù)電氨基酸殘基會(huì)先瞬時(shí)的結(jié)合在通道口部的mSlo

8、1(K330,K331)兩個(gè)正電氨基酸，形成預(yù)失活點(diǎn)PIsite及瞬時(shí)開放態(tài)O*后才會(huì)失活。
　　（2）確定了BK(β2)通道的增強(qiáng)性激活作用點(diǎn)Esite(Enhanced activation site)，它由β2的N端根部的β2(D44,E45)位兩個(gè)負(fù)電氨基酸殘基與位于其下方的mSlo1(K392,R393)兩個(gè)正電氨基酸相結(jié)合而形成，對(duì)與β的結(jié)合及上膜有重要影響。
　　（3）進(jìn)一步確定BK(β2)通道的增強(qiáng)性激活作用

9、來源于ECaB site(ECa2+bowl site)，它是由BK通道的其中一個(gè)鈣結(jié)合位點(diǎn)Ca2+bowl與β2的N端中部的β2(K33,R34,K35)位三個(gè)正電氨基酸殘基相互作用而形成。由此解開BK(β2)通道的增強(qiáng)性激活作用的通路：它由ECaB site產(chǎn)生，經(jīng)E site的定滑輪作用而優(yōu)化了鈣離子門控的力使得S6開門更加容易。
　　（4）同時(shí)也建立了一種研究 BK通道亞基間相互作用的可行又可靠的方法，運(yùn)用此方法以及β亞基