張力敏感性陽離子通道在氣道黏液基礎(chǔ)分泌中的介導(dǎo)作用.pdf

1、目的：探討張力敏感性陽離子通道對氣道黏蛋白(MUC)基礎(chǔ)性分泌的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步完善氣道黏液分泌發(fā)生機(jī)制的理論，為了解氣道黏液基礎(chǔ)性分泌的生理和病理狀態(tài)提供理論依據(jù)。
　　方法：采用氣/液相界面法培養(yǎng)人氣道上皮16HBE細(xì)胞，參考文獻(xiàn)后改裝裝置模擬正常呼吸，按照正常呼吸節(jié)律作用于培養(yǎng)細(xì)胞，檢測反映氣道上皮黏液層穩(wěn)態(tài)的一系列重要指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)分組：(1)靜態(tài)對照組：無節(jié)律性壓力波刺激，僅培養(yǎng)液培養(yǎng)16HBE細(xì)胞；(2)節(jié)律性壓力波組：啟

2、動(dòng)上述裝置模擬正常呼吸產(chǎn)生的壓力波作用于16HBE細(xì)胞；(3)節(jié)律性壓力波+張力敏感性陽離子通道拮抗劑釕紅(RR)組：先于16HBE細(xì)胞中加入RR預(yù)處理，再模擬正常呼吸產(chǎn)生的壓力波組用于16HBE細(xì)胞；(4)節(jié)律性壓力波+維拉帕米：先加入鈣通道抑制劑維拉帕米預(yù)處理，模擬正常呼吸產(chǎn)生的壓力波組用于16HBE細(xì)胞；(5)節(jié)律性壓力波+蛋白激酶C抑制劑(GF109203x)：先加入PKC抑制劑預(yù)處理，再節(jié)律性壓力波作用于細(xì)胞。MTT法測定五組

3、16HBE細(xì)胞生長活性；分組培養(yǎng)48h后，用ELISA檢測各組MUC(2、5AC和5B)蛋白的分泌水平；RT-PCR檢測各組TRPV4及MUC5AC的mRNA水平；Western blot法檢測各組MARCKS及SNAP-23蛋白水平的表達(dá)；在細(xì)胞免疫化學(xué)激光共聚焦顯微鏡下，觀察各組16HBE細(xì)胞中MUC2蛋白表達(dá)的情況及細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化。
　　結(jié)果：(1)5組16HBE細(xì)胞的生存率分別為(93.9±3.1)％、(99.2

4、±4.3)％、(94.6±7.3)％、(96.6±2.3)％和(96.5±5.0)％。靜態(tài)對照組較節(jié)律性壓力波刺激的組別的細(xì)胞生存率減低。(2)節(jié)律性壓力波組內(nèi)MUC(2、5AC和5B)蛋白含量明顯高于靜態(tài)對照組(P<0.01)；RR處理組和維拉帕米、PKC抑制劑后的MUC(2、5AC和5B)蛋白表達(dá)水平較壓力波組明顯降低(P<0.01)。(3)在節(jié)律性壓力波作用后SNAP-23、pSNAP-23及MARCKS、pMARCKS的蛋白表達(dá)

5、水平為1.08％0.48、0.84+0.40、1.15±0.35、0.34±0.56均顯著高于對照組(P<0.01)；同時(shí)可觀察到給予釕紅，鈣通道阻滯劑維拉帕米以及GF109203x預(yù)處理后，pMARCKS及pSNAP-23蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)。(4)在激光共聚焦顯微鏡下可觀察到，靜態(tài)對照組相比較壓力波做的MUC2蛋白熒光強(qiáng)度明顯升高，給予RR、維拉帕米及GF109203x預(yù)處理后，MUC2胞質(zhì)內(nèi)熒光明顯減弱。(5)PCR結(jié)

6、果亦提示壓力波作用后的TRPV4 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于靜態(tài)對照組(P<0.01)；預(yù)先給予RR、維拉帕米及GF109203x處理后，TRPV4的轉(zhuǎn)錄水平有所下降，RR組較明顯，但其水平仍高于對照組(P<0.01)
　　結(jié)論：1.人氣道正常呼吸產(chǎn)生的節(jié)律性壓力波參與維持氣道微環(huán)境中基礎(chǔ)性MUC分泌平衡。
　　2.節(jié)律性壓力波對氣道黏蛋白分泌的影響是通過激活TRPV4蛋白通道，其主要的機(jī)制是通過Ca2+/PKC/MARCK