Ezrin在慢性氣道炎癥黏液分泌中的作用及其分子機(jī)制.pdf

1、目的：
　　明確目標(biāo)人群中支氣管粘膜上皮中Ezrin的表達(dá)特征。
　　探討Ezrin在體外培養(yǎng)的氣道上皮細(xì)胞中的表達(dá)及在黏液分泌中的作用。
　　在細(xì)胞模型中進(jìn)一步研究Ezrin與參與氣道上皮細(xì)胞黏液分泌出胞動作的相關(guān)信號分子之間相互作用，詳細(xì)探討Ezrin/PIP2/MARCKS分子信號鏈參與氣道黏液分泌的過程，以期明確Ezrin參與氣道黏液分泌調(diào)控的具體分子機(jī)制及信號傳導(dǎo)通路。
　　方法：
　　(1)Ez

2、rin在目標(biāo)人群支氣管粘膜上皮中的表達(dá)情況：
　　收集外科行肺葉切除術(shù)患者支氣管粘膜組織，采用免疫組織化學(xué)方法檢測Ezrin蛋白的表達(dá)水平及其分布特點(diǎn)，用Imagepro-plus6.0軟件進(jìn)行圖像分析比較慢性氣道炎癥患者與正常人氣道粘膜上皮組織中的表達(dá)差異，并進(jìn)一步采用Western bolt法及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time PCR)法分別檢測慢性氣道炎癥患者與正常人氣道粘膜上皮組織中Ezrin的蛋白及mRNA的

3、表達(dá)差異。
　　(2)Ezrin在體外培養(yǎng)的氣道上皮細(xì)胞中的表達(dá)及其促黏液分泌效應(yīng)研究：
　　獲得野生型及關(guān)鍵作用位點(diǎn)Thr567定點(diǎn)突變的Ezrin重組質(zhì)粒(pEGFP-N1-ezrin-Wt、pEGFP-N1-ezrin-T567D、pEGFP-N1-ezrin-T567A)，經(jīng)酶切鑒定驗(yàn)證后，轉(zhuǎn)染16HBE細(xì)胞，取得具有EGFP標(biāo)記的Ezrin T567D、T567A、Wt以及pEGFP-N1對照組的系列細(xì)胞株，為后續(xù)

4、功能對照研究提供基礎(chǔ)。體外培養(yǎng)人氣道上皮16HBE細(xì)胞，以不同濃度人嗜中性細(xì)胞彈性蛋白酶(human neutrophil elastase，HNE)刺激細(xì)胞，MTT法檢測其對細(xì)胞活力的影響，real-time PCR法檢測經(jīng)刺激物作用后MUC5AC mRNA表達(dá)水平，酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測細(xì)胞上清液及細(xì)胞裂解液中的MUC5AC蛋白含量，從而選取HNE的最適濃度。以最適濃度的HNE刺激轉(zhuǎn)染野生型Ezrin及Ezrin各型突

5、變體的16HBE細(xì)胞，ELISA法比較HNE作用后各組細(xì)胞MUC5AC蛋白含量的差別，同時(shí)采用Western blot法比較培養(yǎng)細(xì)胞中不同突變體中磷酸化Ezrin蛋白的含量，明確Thr567位點(diǎn)的不同突變體對MUC5AC分泌影響的差異，推斷出其在黏液分泌中的關(guān)鍵作用。
　　(3)Ezrin與胞吐相關(guān)蛋白的定位及相互作用研究：
　　分別將新霉素(PLC特異性抑制劑，可抑制PIP2水解)和CalphostinC(PKC特異性抑制

6、劑)作用于16HBE細(xì)胞，Western blot法檢測細(xì)胞中磷酸化Ezrin的含量，同時(shí)應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色，激光共聚焦顯微鏡觀察PIP2和Ezrin的表達(dá)及細(xì)胞定位情況，以期明確PIP2和PKC對Ezrin磷酸化及頂膜定位的影響。與此同時(shí)，培養(yǎng)的人氣道上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染野生型、Thr567位點(diǎn)各型Ezrin突變體及對照后，分別予以HNE刺激，Western blot檢測細(xì)胞中磷酸化MARCKS的含量，觀察Ezrin對MARCKS磷酸化的影

7、響。最后，將16HBE細(xì)胞轉(zhuǎn)染野生型、PSD突變的MARCKS及對照后，予以HNE刺激后，ELISA檢測胞外分泌的MUC5AC蛋白表達(dá)水平，以期明確MARCKS對MUC5AC蛋白分泌的影響。
　　結(jié)果：
　　(1)Ezrin在目標(biāo)人群支氣管粘膜上皮中的表達(dá)情況：
　　免疫組化結(jié)果顯示磷酸化Eznn蛋白陽性染色細(xì)胞位于支氣管粘膜上皮內(nèi)，集中表達(dá)于纖毛富集的支氣管粘膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜頂端靠腔面?zhèn)?，呈棕黃色。用Imagepr

8、o-plus6.0軟件進(jìn)行圖像分析，把黃色區(qū)域作為評定區(qū)(area of interest，AOI)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：COPD組的支氣管粘膜上皮累積光密度/面積(integrated optical density/area，IOD/area)值(0.28±0.049)顯著高于正常對照組(0.19±0.036)，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。real-time PCR結(jié)果顯示：COPD組支氣管粘膜內(nèi)Ezrin mRNA相對表達(dá)量為對照組的1

9、.18±0.071倍，與正常對照組相比無顯著性差異(P>0.05)。Western-blot結(jié)果顯示：COPD組支氣管粘膜內(nèi)磷酸化Ezrin蛋白表達(dá)量顯著高于正常對照組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　(2)Ezrin在體外培養(yǎng)的氣道上皮細(xì)胞中的表達(dá)及其促黏液分泌效應(yīng)研究：
　　Ezrin重組質(zhì)粒經(jīng)XhoI-BamH I的雙酶切鑒定，各質(zhì)粒的酶切結(jié)果與預(yù)期的一致，確證有目的DNA片段產(chǎn)生，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將上述pE

10、GFP-N1-Ezrin重組質(zhì)粒與空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到16HBE細(xì)胞，24-48h在熒光倒置顯微鏡下觀察四組質(zhì)粒均發(fā)出綠色熒光，說明轉(zhuǎn)染成功。分別予以不同濃度HNE作用于16HBE細(xì)胞，MTT檢測發(fā)現(xiàn)0.01、0.1、0.5μMHNE組與對照組相比細(xì)胞增殖活力無明顯差異，1μM HNE組從第30min開始吸光度降低，較對照組顯著下降(P<0.05)。各濃度梯度HNE刺激下MUC5AC mRNA及蛋白表達(dá)均呈劑量依賴性增加，0.5μM HNE

11、組增加尤為明顯(P<0.01)，其余各濃度組與對照組相比亦有增加(均P<0.05)。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，可選取0.5μM作為HNE的最適濃度來刺激細(xì)胞。
　　轉(zhuǎn)染了Ezrin Thr567位點(diǎn)的不同突變體的16HBE細(xì)胞予以HNE刺激，Western blot及免疫熒光結(jié)果顯示：HNE能誘導(dǎo)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染野生型Ezrin的16HBE細(xì)胞中Ezrin Thr567位點(diǎn)磷酸化蛋白表達(dá)水平的升高(與陰性對照組相比P<0.05)及向細(xì)胞膜的頂膜定位，

12、與vehicle對照組相比，pEGFP-N1-Ezrin-T567D組細(xì)胞中磷酸化Ezrin蛋白含量明顯增高(P<0.05)，分布亦僅集中在胞膜，而pEGFP-N1-Ezrin-T567A組細(xì)胞中磷酸化Ezrin蛋白表達(dá)則明顯降低(P<0.01)，無明顯向胞膜聚集的趨勢，pEGFP-N1-Ezrin-Wt組細(xì)胞中磷酸化Ezrin蛋白表達(dá)略有升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；ELISA結(jié)果顯示：與陰性對照組相比，0.5μM HNE

13、刺激轉(zhuǎn)染Ezrin各型突變體的各組細(xì)胞后胞外分泌和胞內(nèi)儲存的MUC5AC蛋白含量均明顯升高(P<0.05)，與vehicle對照組和野生型Ezrin組相比，pEGFP-N1-Ezrin-T567D組細(xì)胞分泌出胞外的MUC5AC蛋白含量顯著增高(P<0.01)，細(xì)胞內(nèi)的MUC5AC蛋白含量則明顯減少(P<0.05)，與此相對應(yīng)的pEGFP-N1-Ezrin-T567A組細(xì)胞分泌出胞外的MUC5AC蛋白較vehicle對照組減少(P<0.0

14、1)，而細(xì)胞內(nèi)的MUC5AC蛋白較vehicle對照組增加(P<0.05)。
　　(3)Ezrin與胞吐相關(guān)蛋白定位及相互作用研究：
　　予以Calphostin C預(yù)處理16HBE細(xì)胞后再予以HNE刺激16HBE細(xì)胞，Western blot結(jié)果顯示：PKC特異性抑制劑Calphostin C明顯抑制HNE誘導(dǎo)的Ezrin Thr567位點(diǎn)磷酸化蛋白和MARCKS磷酸化蛋白表達(dá)，與HNE組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，

15、與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。使用PLC的特異性抑制劑新霉素后，抑制HNE誘導(dǎo)的PLC對PIP2水解，胞膜上PIP2增多，但免疫熒光和激光共聚焦檢測顯示磷酸化Ezrin蛋白的減少以及胞膜定位的pEzrin較HNE組減少，未能實(shí)現(xiàn)頂膜定位。16HBE細(xì)胞轉(zhuǎn)染野生型、Thr567位點(diǎn)各型Ezrin突變體及對照質(zhì)粒后，分別予以HNE刺激，Western blot顯示與vehicle對照組和野生型Ezrin轉(zhuǎn)染組相比，pEGFP