白介素13誘導(dǎo)氣道黏液高分泌的機(jī)制及其調(diào)控研究.pdf

1、杯狀細(xì)胞化生和黏液高分泌是哮喘、慢性阻塞性肺疾病等慢性氣道炎性疾病的標(biāo)志性特征。正常的黏液分泌是防止病原微生物和毒素攻擊的有效屏障，也是氣道先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分。在慢性炎癥等病理狀態(tài)下，氣道黏液大量分泌，導(dǎo)致反復(fù)呼吸道感染和氣道阻塞。黏液高分泌引起的氣道阻塞是慢性氣道炎性疾病發(fā)生和發(fā)展的重要原因，在慢性氣道炎性疾病進(jìn)展的過(guò)程中，中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、活性氧簇和多種細(xì)胞因子會(huì)損傷氣道，導(dǎo)致黏蛋白大量合成和分泌。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有

2、20種不同的黏蛋白(mucin，MUC)基因，其中，氣道最主要的分泌型黏蛋白是MUC5AC，主要由杯狀細(xì)胞分泌。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)MUC5AC上調(diào)表達(dá)和杯狀細(xì)胞化生是氣道黏液高分泌的主要特征性表現(xiàn)。
　　支氣管哮喘是慢性氣道炎性疾病的代表，黏液高分泌是支氣管哮喘重要的病理特征，氣道黏液高分泌已經(jīng)成為影響哮喘病情和預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。在支氣管哮喘患者中，活化的Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，可以直接激活肥大細(xì)胞，Th2型細(xì)胞因子主要包括白介素1

3、3(Interleukin-13，IL-13)、IL-9、IL-5和IL-4，其中IL-13和支氣管哮喘關(guān)系最為密切，也是目前研究最為深入的炎性因子。
　　在支氣管哮喘中，氧化和抗氧化的失衡是導(dǎo)致氣道黏液高分泌的另一個(gè)重要原因。IL-13刺激后細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygenspecies，ROS)顯著上升，ROS能夠損傷細(xì)胞的大分子結(jié)構(gòu)例如DNAs，類脂和蛋白質(zhì)，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激所誘導(dǎo)的組織損傷。氧化-抗氧化失衡可

4、能是IL-13誘導(dǎo)黏液高分泌發(fā)生的重要機(jī)制，由于氧化應(yīng)激在慢性氣道炎性疾病的發(fā)生發(fā)展中居重要地位，因此抗氧化是治療黏液高分泌的重要思路。
　　目的：
　　本研究在細(xì)胞模型中探討IL-13對(duì)MUC5AC的轉(zhuǎn)錄和合成的影響，并探討相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　從抗氧化的思路出發(fā)，選擇醛糖還原酶抑制劑作為干預(yù)因素，研究醛糖還原酶抑制劑對(duì)IL-13誘導(dǎo)的MUC5AC過(guò)度合成的影響及其分子機(jī)制。
　　方法：
　　在細(xì)胞模

5、型中研究IL-13對(duì)MUC5AC轉(zhuǎn)錄和蛋白合成的影響：
　　培養(yǎng)人氣道上皮細(xì)胞株(Human bronchial epithelial16，HBE16)，在IL-13刺激前予以無(wú)血清培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)24小時(shí)。實(shí)驗(yàn)分為以下四組：對(duì)照組(加入PBS)、10 nM IL-13組、25 nM IL-13組、50 nM IL-13組。通過(guò)四甲基偶氮唑鹽光吸收法{3-(4，5-dimethiylthiazol-2-y1)-2，5-dipheny

6、l tetrazolium bromide，MTT法}檢測(cè)IL-13刺激后細(xì)胞活性的變化；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Retrovirus-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測(cè)IL-13刺激后MUC5AC mRNA表達(dá)的變化；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)檢測(cè)IL-13刺激后MUC5AC蛋白表達(dá)的變化。
　　在細(xì)胞模型中研究IL-1

7、3刺激黏液高分泌的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑
　　通過(guò)細(xì)胞模型研究IL-13刺激黏液高分泌的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。培養(yǎng)人氣道上皮細(xì)胞株HBE16細(xì)胞，在IL-13刺激前予以無(wú)血清培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)24小時(shí)。A771726用來(lái)特異性抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子6(Signal Transducer and Activator of Transcription6，STAT6)的表達(dá)。通過(guò)RT-PCR檢測(cè)STAT4，STAT6，p38和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(Ext

8、racellular signal regulated kinase1/2，ERK1/2)mRNA表達(dá)的變化，通過(guò)western blotting檢測(cè)STAT6，p38和ERK1/2蛋白表達(dá)的變化。通過(guò)凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(Electrophoretic Mobility Shift Assays，EMSA)檢測(cè)FOXA2(The forkhead box transcription factor A2，F(xiàn)OXA2)和激活蛋白1(Activat

9、ion protein-1，AP-1)的DNA結(jié)合活性的變化。通過(guò)細(xì)胞免疫化學(xué)、激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)IL-13刺激后跨膜蛋白16A(transmembrane protein16A，TMEM16A)和富含丙氨酸的豆蔻?；鞍准っ窩的作用底物(Myristoylated Alaninerich C Kinase Substrate，MARCKS)蛋白表達(dá)的變化。
　　抑制醛糖還原酶(Aldose reductase，AR)對(duì)IL-13

10、誘導(dǎo)的黏液分泌的作用及其分子機(jī)制研究：
　　通過(guò)MTT方法檢測(cè)zopolrestat對(duì)HBE16細(xì)胞活力的影響。合成以往實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證有效的醛糖還原酶siRNA干擾序列。HBE16細(xì)胞饑餓培養(yǎng)24小時(shí)后，加入zopolrestat或者AR siRNA，然后加入IL-13刺激24小時(shí)。通過(guò)RT-PCR或者ELISA檢測(cè)MUC5AC的轉(zhuǎn)錄和蛋白合成的變化。通過(guò)熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS生成的變化。通過(guò)westernblotting方法檢測(cè)AR

11、、p-STAT6和激酶2(Janus Kinase2，JAK2)蛋白表達(dá)的變化。
　　結(jié)果：
　　IL-13對(duì)MUC5AC轉(zhuǎn)錄和蛋白合成的影響：
　　IL-13能夠減弱HBE16細(xì)胞的活力，對(duì)HBE16細(xì)胞活力的影響呈劑量依賴性。同對(duì)照組相IL-13刺激后MUC5AC基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其效應(yīng)呈劑量相關(guān)性(均P<0.05)。
　　IL-13刺激黏液高分泌的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制
　　通過(guò)RT

12、-PCR和western blotting檢測(cè)IL-13刺激后細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)的變化。和對(duì)照組相比，p-STAT6的表達(dá)顯著增高(P<0.05)，而P-ERK1/2的表達(dá)沒(méi)有顯著變化(P>0.05)。在加入STAT6特異性抑制劑A771726后，IL-13誘導(dǎo)的MUC5AC基因轉(zhuǎn)錄和蛋白合成顯著降低(P<0.05)。IL-13刺激后24-48d，時(shí)能夠檢測(cè)到p38蛋白合成增加。IL-13刺激后FOXA2的DNA結(jié)合活性顯

13、著降低，而AP-1的DNA結(jié)合活性沒(méi)有顯著變化(P>0.05)。IL-13能夠顯著刺激細(xì)胞內(nèi)ROS合成增加(P>0.05)，在48小時(shí)仍能持續(xù)刺激ROS生成。通過(guò)免疫熒光檢測(cè)IL-13刺激后TMEM16A和MARCKS蛋白表達(dá)的變化，IL-13能夠顯著增加TMEM16A和MARCKS的蛋白表達(dá)(P<0.05)。
　　醛糖還原酶抑制劑干預(yù)IL-13誘導(dǎo)的黏液分泌及其分子機(jī)制研究：
　　Zopolrestat或者醛糖還原酶-小分

14、子干擾RNA(AldoseReductase-Short interfering RNA，AR-siRNA)能夠顯著抑制IL-13誘導(dǎo)的MUC5AC的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。zopolrestat或者AR-siRNA能夠顯著減少IL-13誘導(dǎo)的ROS生成(P<0.05)、抑制p-JAK2和p-STAT6的表達(dá)(P<0.05)，從而減少黏液產(chǎn)物的生成。
　　結(jié)論：
　　1、IL-13能夠在細(xì)胞模型中顯

15、著刺激MUC5AC的轉(zhuǎn)錄和蛋白合成，IL-13刺激黏液分泌的效應(yīng)呈劑量相關(guān)性，隨著劑量增加，細(xì)胞活力也相應(yīng)減弱。
　　2、IL-13刺激后STAT6的轉(zhuǎn)錄和蛋白合成顯著增強(qiáng)，而ERK1/2的表達(dá)沒(méi)有顯著變化。IL-13刺激后FOXA2的DNA結(jié)合活性顯著降低，提示IL-13可能通過(guò)JAK2/STAT6-FOXA2通路刺激黏蛋白合成增加。
　　3、IL-13能夠通過(guò)P38/MAPK信號(hào)通路刺激黏蛋白合成增加，p38/MAPK信

16、號(hào)通路需要依賴STAT6信號(hào)通路的激活。
　　4、IL-13刺激后TMEM16A和MARCKS表達(dá)顯著增加，IL-13可能通過(guò)TMEM16A和MARCKS調(diào)控黏蛋白的分泌。
　　5、IL-13刺激后細(xì)胞內(nèi)ROS生成顯著增加，氧化應(yīng)激可能是IL-13引起黏液分泌的重要機(jī)制，抑制醛糖還原酶能夠減少IL-13誘導(dǎo)的ROS生成。
　　6、醛糖還原酶在慢性氣道炎性疾病黏液高分泌的發(fā)生中居重要地位，抑制醛糖還原酶能夠減少細(xì)胞內(nèi)RO