柚皮素對炎癥性氣道黏液高分泌的影響及機制.pdf

1、目的:探討柚皮素對炎性刺激時氣道上皮細胞黏液高分泌的作用和相關(guān)的分子機制。
　　 方法:(1)體外培養(yǎng)人氣道上皮細胞系HBE16細胞,將細胞分為7組,分別以0、20、50、80、100、200、400μmol/L的柚皮素處理,采用四甲基偶氮唑鹽光吸收法(MTT法)檢測柚皮素對細胞活性的影響,并確定柚皮素的作用劑量。(2)給予不同濃度(5nmol/L、25nmol/L和50nmol/L)的人中性粒細胞彈性蛋白酶(HNE)刺激24

2、h,觀察刺激前后細胞的生長和增殖情況,分別采用ELISA技術(shù)及PCR檢測各組細胞中MUC5AC蛋白含量及轉(zhuǎn)錄水平的變化情況,并測定活性氧(ROS)成分的相對含量；(3)將細胞分為5組:①對照組；②HNE(50nmol/L)刺激組；③柚皮素(100μmol/L)干預組；④活性氧清除劑DMTU(20μmol/L)干預組；⑤柚皮素(100μmol/L)+DMTU(20μmol/L)干預組。逆轉(zhuǎn)錄.聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測各組MUC5A

3、C mRNA、EGFR mRNA的變化；Western免疫印跡法(Western blot)檢測EGFR、p-EGFR、P13K、PKB、p-PKB和NF-kB蛋白的表達；酶鏈免疫吸附法(ELISA)定量分析MUC5AC蛋白含量的差異；激光共聚焦技術(shù)進一步直接觀察MUC5AC蛋白含量的變化；
　　 結(jié)果:(1)MTT結(jié)果顯示柚皮素濃度低于100μmol/L時對細胞無明顯損傷,隨著濃度遞增,當柚皮素濃度達2001μmol/L和40

4、0μmol/L時細胞貼壁能力降低,死亡細胞增多,細胞生存率明顯下降,此表明100μmol/L的柚皮素為最佳作用劑量；(2)在5nmol/L、25nmol/L和50nmol/L的HNE刺激后的各組細胞中MUC5AC的轉(zhuǎn)錄水平及蛋白含量均增高,ROS含量亦隨之增加,呈濃度依賴性增高,均高于正常對照組；給予柚皮素預處理后ROS的含量明顯減少,與50nmol/L的HNE刺激組相比,差異均有統(tǒng)計學意義(P〈0.01)。(3)50nmol/L的HN

5、E刺激后引起MUC5AC、EGFR基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平明顯高于正常對照組(P〈0.01),同時伴隨p-EGFR、P13K、PKB、p-PKB及NF-kB蛋白水平的增高,與正常對照組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；柚皮素干預后,RT-PCR測定MUC5AC mRNA和EGFR mRNA均較HNE刺激組明顯下調(diào),Western blot的結(jié)果也表明相應的EGFR和p-EGFR蛋白表達明顯降低,其下游因子P13K、PKB、p-PKB

6、及NF-kB蛋白表達也有不同程度的減弱(P<0.05)；DMTU和柚皮素+DMTU均同樣降低了MUC5AC、EGFR的基因轉(zhuǎn)錄、蛋白產(chǎn)物水平以及p-EGFR、P13K、PKB、p-PKB及NF-kB蛋白相對含量；柚皮素+DMTU干預組與單純性柚皮素組和DMTU組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；酶鏈免疫吸附法測定結(jié)果表明經(jīng)柚皮素預處理后MUC5AC蛋白表達減少；激光共聚焦觀察結(jié)果也顯示柚皮素處理后HBE16細胞質(zhì)中MUC5AC蛋白

7、表達減弱。
　　 結(jié)論:(1)HNE能刺激氣道上皮細胞黏蛋白MUC5AC基因轉(zhuǎn)錄及蛋白合成分泌增加,且伴有ROS含量的顯著增高；而柚皮素能降低細胞內(nèi)ROS水平。(2)HNE通過增加ROS含量,上調(diào)EGFR的表達水平和增加其磷酸化水平引起MUC5AC表達增強。(3)柚皮素可抑制RDS的產(chǎn)生、下調(diào)ROS誘導的EGFR.表達水平、并部分阻斷EGFR磷酸化,在一定程度上阻斷了下游信號通路P13K/PKB的作用,從而對炎性刺激因素所導致的