基于TRPV1通道探討縮泉丸對大鼠膀胱過度活動癥的作用機(jī)制.pdf

1、膀胱的主要生理功能是儲尿與排尿。正常的膀胱感覺功能是實(shí)現(xiàn)膀胱儲尿和排尿生理過程的基礎(chǔ)，且該過程有賴于神經(jīng)系統(tǒng)、膀胱逼尿肌和尿道括約的協(xié)調(diào)。膀胱感覺功能主要對下尿路牽張所引起的膨脹、溫度、痛覺和傷害性刺激的主觀感知。因此，膀胱神經(jīng)傳導(dǎo)、逼尿肌功能等的改變成為膀胱過度活動癥的主要誘因，且最新研究發(fā)現(xiàn)TRPV1在維持膀胱正常排尿功能的機(jī)械感覺中起重要作用，而OAB的發(fā)生與膀胱TRPV1的表達(dá)異常及其介導(dǎo)的信號傳遞異常密切相關(guān)?？s泉丸在膀胱過度

2、活動癥的治療中取得了廣泛而可靠的療效，但其具體作用機(jī)制尚未十分明確，前期研究發(fā)現(xiàn)縮泉丸可從肌源性及神經(jīng)源性改善膀胱功能，本課題將通過觀察縮泉丸對TRPV1表達(dá)及信號傳導(dǎo)的作用，觀察其對膀胱感覺功能及運(yùn)動功能的影響，深入詮釋和闡明縮泉丸治療OAB的藥理學(xué)作用及機(jī)制，為完善縮泉丸改善膀胱功能的作用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。
　　目的:
　　研究從OAB模型動物及TRPV1基因敲除動物著手，探討縮泉丸改善膀胱運(yùn)動功能及感覺功能治療OAB的

3、作用機(jī)制。運(yùn)用傳統(tǒng)的理論與現(xiàn)代的分子生物、電生理學(xué)技術(shù)相結(jié)合的方法，首先通過觀察OAB模型大鼠膀胱TRPV1的分布及表達(dá)、TRPV1基因敲除小鼠膀胱功能的變化，以驗(yàn)證TRPV1在膀胱功能中的作用;而后通過觀察縮泉丸對OAB模型大鼠排尿活動及尿動力學(xué)參數(shù)的變化、對TRPV1在膀胱表達(dá)的變化、對大鼠神經(jīng)傳入電活動的改變;并探討縮泉丸對TRPV1信號通路的作用。多層次深入揭示縮泉丸基于TRPV1治療OAB的作用機(jī)制。
　　方法:

4、　　1 OAB模型探索——膀胱出口梗阻大鼠尿動力學(xué)動態(tài)變化的研究
　　以膀胱出口梗阻法復(fù)制OAB模型大鼠，并以假手術(shù)組作為對照，分別于2、4、6周后對相應(yīng)的模型組及假手術(shù)組進(jìn)行尿動力學(xué)檢測，觀察其膀胱壓力、容量及儲尿期逼尿肌不穩(wěn)定收縮情況的變化，以確立合適的動物模型用于課題研究。
　　2 TRPV1在膀胱功能中的作用研究
　　2.1 OAB模型大鼠膀胱中TRPV1的表達(dá)
　　根據(jù)“1”的實(shí)驗(yàn)結(jié)果所確立的合適的動物

5、模型建立條件，以相同的方法復(fù)制得到OAB模型大鼠;獲取模型及假手術(shù)大鼠的膀胱，以免疫熒光組織化學(xué)法通過激光共聚焦顯微鏡觀察TRPV1在各組大鼠膀胱中的分布情況;采用RT-PCR、westernblot檢測各組大鼠膀胱TRPV1mRNA及蛋白的表達(dá)。
　　2.2 TRPV1-/-小鼠膀胱充盈期盆神經(jīng)傳入電活動的影響
　　從南京模式生物研究所復(fù)蘇得到TRPV1-/-小鼠，并以野生型小鼠作為對照，通過尿墊實(shí)驗(yàn)觀察野生型小鼠與TRP

6、V1基因敲除小鼠排尿活動的變化;以多通道生理信號記錄儀記錄盆神經(jīng)在灌注過程中的電信號變化，同時尿動力儀進(jìn)行膀胱內(nèi)測定，分別進(jìn)行膀胱內(nèi)灌注NS、CAP、CPZ，觀察灌注過程中盆神經(jīng)放電信號隨膀胱壓力、容量的變化。
　　3縮泉丸改善OAB大鼠膀胱功能的作用及機(jī)制研究
　　3.1縮泉丸對OAB模型大鼠排尿活動及膀胱功能的影響
　　根據(jù)“1”的實(shí)驗(yàn)結(jié)果確立的模型建立時間，以相同的方法復(fù)制得到模型大鼠;灌胃以縮泉丸進(jìn)行治療，末次

7、給藥后以尿動力儀檢測各組大鼠膀胱功能的變化，并進(jìn)行排尿活動觀察。
　　3.2縮泉丸對OAB模型大鼠膀胱TRPV1表達(dá)的影響
　　以相同的方法復(fù)制得到模型大鼠;縮泉丸干預(yù)后獲取膀胱，以“2.1”的方法模型大鼠及縮泉丸治療后膀胱TRPV1的分布情況及其mRNA、蛋白的表達(dá)。
　　3.3縮泉丸對OAB大鼠膀胱充盈期盆神經(jīng)傳入電活動的影響
　　以相同的方法復(fù)制得到模型大鼠;以縮泉丸進(jìn)行干預(yù)，末次給藥后，以“2.2”的方法

8、觀察縮泉丸干預(yù)后大鼠膀胱灌注過程中盆神經(jīng)放電信號隨膀胱壓力、容量的變化。
　　4探討縮泉丸對TRPV1信號通路的調(diào)控
　　4.1縮泉丸對TRPV1-/-小鼠離體逼尿肌功能的影響
　　以TRPV1轉(zhuǎn)基因小鼠為研究對象，獲取膀胱逼尿肌肌條，采用powerlab多通道生理記錄儀檢測縮泉丸對TRPV1-/-離體逼尿肌條α，β-meATP、Carbachol、CAP、KCl誘發(fā)的逼尿肌條舒縮反應(yīng)的影響;收集加入CAP反應(yīng)后的Kr

9、ebs試液以熒光素?zé)晒馑孛赴l(fā)檢測ATP的釋放量。
　　4.2縮泉丸對TRPV1-/-小鼠膀胱TRPV1、P2X3 mRNA及蛋白表達(dá)的影響
　　以TRPV1轉(zhuǎn)基因小鼠為研究對象，采用RT-PCR、western blot檢測TRPV1-/-小鼠及縮泉丸干預(yù)后膀胱TRPV1、P2X3 mRNA及蛋白在膀胱中的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1確立OAB大鼠模型復(fù)制條件
　　尿動力學(xué)檢測結(jié)果顯示，2、4周模型組的BLP

10、P、MVP、MBC與相應(yīng)的假手術(shù)對照組比較明顯升高;4周模型組RV、NVC與假手術(shù)對照組相比明顯增多;6周模型組的壓力及容量指標(biāo)亦比假手術(shù)組高，其RV顯著增多，即使與2、4周組比亦有顯著差異，但其NVC有下降趨勢，顯示模型6周后可能進(jìn)入失代償期。因此應(yīng)選擇4周前的模型。
　　2 TRPV1參與了膀胱的運(yùn)動功能及感覺功能
　　OAB大鼠膀胱TRPV1的分布及其mRNA、蛋白表達(dá)顯著升高;而當(dāng)敲除該基因后，小鼠出現(xiàn)排尿反射延長、

11、間隔加長、次數(shù)減少的現(xiàn)象，其排尿壓力降低，且膀胱充盈期間盆神經(jīng)放電與野生型小鼠相比明顯減弱;野生型小鼠膀胱內(nèi)灌注TRPV1激動劑CAP可使膀胱壓力升高、神經(jīng)放電增強(qiáng)，而拮抗劑呈相反的效應(yīng);而TRPV1-/-小鼠對CAP及CPZ膀胱內(nèi)灌注無明顯反應(yīng)。
　　3縮泉丸可能通過改善逼尿肌功能及神經(jīng)感覺功能而治療OAB，該機(jī)制可能與其調(diào)節(jié)TRPV1在膀胱的表達(dá)有關(guān)
　　縮泉丸能穩(wěn)定膀胱逼尿肌，明顯減少排尿次數(shù)，改善尿動力學(xué)參數(shù)，改善膀

12、胱功能;其不同劑量均能使OAB模型大鼠膀胱內(nèi)TRPV1的分布明顯減少，使其mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯下降;呈較明顯的量效關(guān)系。OAB大鼠盆神經(jīng)放電模式表現(xiàn)為:放電頻率先于壓力達(dá)到峰值，而后壓力達(dá)到峰值時，放電頻率趨于平臺或下降。OAB模型大鼠膀胱充盈過程中盆神經(jīng)放電頻率明顯增強(qiáng)，縮泉丸的干預(yù)能降低盆神經(jīng)的放電沖動，減少神經(jīng)放電增強(qiáng)引起的逼尿肌不穩(wěn)定收縮，并呈劑量依賴性。CAP進(jìn)行膀胱灌注后，能引起假手術(shù)對照組盆神經(jīng)放電增強(qiáng)，膀胱壓力及容

13、量增加，不穩(wěn)定收縮增多;此效應(yīng)可被CPZ阻斷。CAP內(nèi)灌注可能因?qū)RPV1高表達(dá)的OAB大鼠膀胱產(chǎn)生去神經(jīng)化作用，反而能降低其放電增強(qiáng)的情況，減少膀胱壓力及容量，并能減少其不穩(wěn)定收縮;CPZ能顯著減少OAB大鼠膀胱TRPV1的分布及表達(dá)，使其神經(jīng)放電減弱，膀胱壓力及容量下降;縮泉丸干預(yù)后，高、中劑量組可減輕模型動物對CAP灌注所引起的效應(yīng)，對CPZ灌注無明顯變化，提示縮泉丸通過調(diào)控TRPV1的表達(dá)減輕CAP刺激對膀胱的傷害。
　

14、　4縮泉丸對TRPV1信號通路的調(diào)控
　　TRPV1-/-小鼠逼尿肌條ATP釋放量明顯下降，對CAP刺激無明顯反應(yīng)，對α，β-meATP、KCl、carbachol的所誘發(fā)的收縮反應(yīng)明顯下降;TRPV1-/-小鼠膀胱內(nèi)未見TRPV1 mRNA及蛋白的表達(dá)，其P2X3的表達(dá)量明顯下降;縮泉丸高、低劑量可提高TRPV1-/-小鼠離體肌條ATP釋放量，提高其對α，β-me ATP、CAP、KCl及不同濃度的carbachol刺激所誘發(fā)的