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文檔簡介
1、背景:近年來研究表明,在高血壓、冠心病、動脈粥樣硬化等心血管疾病發(fā)生與發(fā)展的不同階段,炎癥是其主要的、共同的病理生理學特征。心血管疾病往往是一種以血管內(nèi)皮細胞損傷、單核/巨噬細胞浸潤為特征的慢性炎癥反應性疾病。因此,抑制炎癥反應可能成為當今和未來治療心血管疾病有前途的方法之一。前期我們研究結果提示,瞬時受體電位香草酸亞型1(transient receptor potential vanilloid subfamilymember1,T
2、RPVl)具有抑制血管內(nèi)皮細胞所介導的炎癥反應的功效,在此基礎上,探明TRPV1受體對單核/巨噬細胞功能的調(diào)控作用,進一步揭示TRPV1受體抗炎作用機制,對于防治心血管疾病及慢性炎癥反應性疾病具有重要的基礎與臨床意義。
cell line,THP-1)培養(yǎng)模型上,通過觀察 TRPV1受體對脂多糖內(nèi)毒素(lipopolysaccharide,LPS)誘導THP-1分化為M1型巨噬細胞所產(chǎn)生的細胞因子及其所表達的誘導型一氧化氮合酶
3、(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的影響,以及吳茱萸堿(Evodiamine,EVO)通過TRPV1受體對該過程的影響作用,從而闡明TRPV1受體對M1型巨噬細胞功能的調(diào)控作用及吳茱萸堿的干預作用,為進一步揭示TRPV1受體及吳茱萸堿抗炎作用機制奠定基礎。
目的:本研究在人急性單核細胞白血病細胞(human acute monocyticleukemia
方法:
1
4、.將對數(shù)生長期的THP-1細胞以5×105/ml/well接種24孔板,待24小時后細胞長至80%以上開始進行加藥刺激,實驗分為以下6組:
?、湃苊浇M:加入終濃度為1/20000的二甲基亞楓(dimethyl sulfoxide,DMSO)和Tween-80;
?、芁PS+溶媒組:加入 LPS使其終濃度為1μg/ml,處理15分鐘后,加入終濃度為1/20000的DMSO和Tween-80;
?、荂AP+LPS組:
5、先加入TRPV1特異性激動劑辣椒素(Capsaicin,CAP)使其終濃度為10umol/L,處理15分鐘后,再加入LPS使其終濃度為1μg/ml;
?、菴APZ+CAP+LPS組:先加入TRPV1特異性拮抗劑辣椒卓平(Capsazepin,CAPZ)使其終濃度為10umol/L,處理15分鐘后,加入CAP使其終濃度為10umol/L,再處理15分鐘后,加入LPS使其終濃度為1μg/ml;
?、蒃VO+LPS組:先加入E
6、VO使其終濃度為10umol/L,處理15分鐘后,再加入LPS使其終濃度為1μg/ml;
?、蔆APZ+EVO+LPS組:先加入TRPV1特異性拮抗劑CAPZ使其終濃度為10umol/L,處理15分鐘后,加入EVO使其終濃度為10umol/L,再處理15分鐘后,加入LPS使其終濃度為1μg/ml;
2.收集各組上清液,利用ELISA法確定TRPV1受體對THP-1細胞在LPS刺激6小時和24小時后誘導分化為M1型巨噬細
7、胞所產(chǎn)生細胞因子[腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)和白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)]的影響。
3.收集各組培養(yǎng)細胞,利用Western-blot法確定TRPV1受體對THP-1細胞在LPS刺激6小時和24小時后誘導分化為M1型巨噬細胞所表達iNOS蛋白量的影響。
4.收集各組上清液,利用
8、 ELISA法確定吳茱萸堿通過 TRPV1受體對 THP-1細胞在LPS刺激6小時后誘導分化為M1型巨噬細胞所產(chǎn)生細胞因子TNF-α、IL-6的影響。
每組實驗重復三次。
結果:
1.TRPV1受體對LPS所誘導的M1型巨噬細胞產(chǎn)生細胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的影響與溶媒組相比,THP-1細胞經(jīng)LPS刺激6小時和24小時后,細胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)的產(chǎn)生明顯增加(P<0.05
9、),利用 CAP激活 TRPV1受體后可明顯抑制 LPS的作用(P<0.05),且該抑制作用可被 TRPV1受體的拮抗劑 CAPZ所逆轉(zhuǎn)。
2. TRPV1受體對LPS所誘導的M1型巨噬細胞表達iNOS蛋白量的影響與溶媒組相比,THP-1細胞經(jīng)LPS刺激6小時和24小時后,iNOS蛋白量的表達明顯增加(P<0.05),利用CAP激活TRPV1受體后可明顯抑制 LPS的作用(P<0.05),且該抑制作用可被TRPV1受體的拮抗劑
10、CAPZ所逆轉(zhuǎn)。
3.吳茱萸堿通過 TRPV1受體對 LPS所誘導的M1型巨噬細胞產(chǎn)生細胞因子TNF-α和IL-6的影響與溶媒組相比,THP-1細胞經(jīng) LPS刺激6小時后,細胞因子 TNF-α和IL-6的產(chǎn)生明顯增加(P<0.05),利用EVO干預后可明顯抑制LPS的作用(P<0.05),且該抑制作用可部分被TRPV1受體的拮抗劑CAPZ所逆轉(zhuǎn)。
結論:
1.在THP-1細胞培養(yǎng)模型上,激活TRPV1受體后
11、能夠抑制 LPS所誘導的M1型巨噬細胞產(chǎn)生細胞因子及表達iNOS的量,提示TRPV1受體可明顯抑制M1型巨噬細胞產(chǎn)生細胞因子及表達iNOS的能力。
2.在THP-1細胞培養(yǎng)模型上,吳茱萸堿能夠抑制LPS所誘導的M1型巨噬細胞產(chǎn)生細胞因子的量,且該抑制作用可部分被 TRPV1受體拮抗劑所逆轉(zhuǎn),提示吳茱萸堿可能通過激活TRPV1受體抑制炎癥反應。
3.根據(jù)本實驗結果,我們推測 TRPV1受體可抑制M1型巨噬細胞的功能,以
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