外周神經電刺激在治療膀胱過度活動癥中的作用及其機制研究.pdf

1、前言：
　　膀胱過度活動癥(OAB)是一種以尿急為主要特征的癥候群，通常伴有尿頻和夜尿癥狀，伴或不伴有急迫性尿失禁，不包括由尿路感染或其他明確的病理改變所導致的癥狀。OAB對患者的生活質量產生嚴重的影響，并給個人及社會帶來較大的心理負擔和經濟壓力。OAB發(fā)病原因尚不清楚。目前OAB一線治療方案包括行為治療和藥物治療。抗膽堿能藥物是目前治療OAB最常用的藥物，其療效和安全性比較肯定，但口干、便秘、眩暈等副作用嚴重影響患者的依從性，治

2、療效果并不滿意。
　　神經電刺激主要是通過電刺激外周神經對膀胱和尿道的功能進行調控，當一線治療失敗后，可以考慮神經電刺激治療。骶神經調控是臨床上應用最早的神經電刺激治療，目前骶神經調控和脛神經電刺激已經通過美國FDA認證并批準為治療OAB的方法，AUA和EAU的指南均推薦神經電刺激治療用于藥物治療失敗的OAB患者。同時，最新的研究結果提示陰部神經電刺激也可以用來治療OAB及急迫性尿失禁等。但是，神經電刺激的作用機理、作用部位、參與

3、的神經遞質以及激活的受體目前仍不明確。
　　膀胱的儲尿過程和排尿過程高度依賴于膀胱和尿道的肌肉的協(xié)同作用，這種協(xié)同作用主要是通過位于大腦、腦橋以及脊髓和外周神經節(jié)來進行調控的。正常生理情況下，有髓鞘的Aδ傳入纖維激活并傳遞膀胱內壓力，經脊髓傳遞至腦橋，然后經過脊髓，將信息下傳至膀胱，進而激發(fā)一種非傷害性的脊髓-腦-脊髓-膀胱長反射。而在泌尿系統(tǒng)的感染及其他刺激等引起的病理狀態(tài)下，可以通過激活無髓鞘的C傳入纖維，將信號傳遞至脊髓，激

4、發(fā)脊髓-膀胱短反射。
　　目前研究發(fā)現(xiàn)多種神經遞質參與外周神經電刺激對膀胱活動的調控，我們課題組前期的研究結果發(fā)現(xiàn)，GABAA受體在陰部神經電刺激調控膀胱過度活動中發(fā)揮重要的作用，并且發(fā)揮作用的位置位于脊髓;而甘氨酸受體(Glycine)和阿片類受體(Opioid)只發(fā)揮很小或者不發(fā)揮作用。然而，前期關于阿片類受體和脛神經電刺激調控膀胱過度活動的研究發(fā)現(xiàn)，阿片類受體在脛神經調控中發(fā)揮重要的作用，在腦橋給予阿片類受體拮抗劑后可以消除

5、脛神經電刺激的抑制作用，在急性胸髓橫斷(T8-9)橫斷后，PNS的抑制作用還在，而TNS抑制作用消失，說明阿片類受體參與調控脛神經電刺激抑制膀胱過度活動的過程，并且是在脊髓以上的位置進行調控。
　　大麻素受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體的一種，主要包括兩個亞型:大麻素受體Ⅰ型和Ⅱ型，其中大麻素受體Ⅰ型主要分布在中樞神經系統(tǒng)，大麻素受體Ⅱ型主要分布在免疫系統(tǒng)。在排尿反射中，大麻素受體Ⅰ型和Ⅱ型主要分布于大鼠和人類的膀胱尿路上皮和神經內，同時大

6、麻素受體和阿片類受體分享很多相似的藥理機制，并且二者在中樞神經發(fā)揮相互協(xié)同作用。
　　因為最新研究發(fā)現(xiàn)陰部神經傳入纖維是經過骶1和骶2背根神經進入脊髓的，脛神經傳入纖維經L7進入脊髓，另外，大麻素受體和阿片類受體在中樞神經系統(tǒng)的相互作用已經被證實。并且，我們課題組前期研究證明，通過貓膀胱內灌注乙酸，可以誘發(fā)膀胱過度活動，行膀胱壓力容積測定，并聯(lián)合外周神經電刺激，證明骶神經調控、脛神經電刺激、陰部神經電刺激均可以增加膀胱容量。

7、>　　因此，本研究主要包括以下兩個部分:第一部分首先誘導貓OAB模型，然后行骶神經調控，通過靜脈或鞘內注射GABAA受體拮抗劑印防己毒素(Picrotoxin)，靜脈注射甘氨酸(Glycine)受體拮抗劑士的寧，鞘內注射阿片類(Opioid)受體拮抗劑納絡酮等藥物，分析膀胱容量變化，以此來研究GABAA，Glycine和Opioid受體在骶神經調控治療膀胱過度活動中的作用及調控機制。第二部分誘導貓OAB模型后，電刺激脛神經和陰部神經聯(lián)合

8、大麻素受體Ⅰ型拮抗劑AM251（靜脈注射或鞘內注射），分析膀胱容量變化，研究大麻素受體Ⅰ型在脛神經和陰部神經電刺激治療膀胱過度活動中的作用及調控機制。
　　第一部分:GABAA，Glycine和Opioid受體在骶神經調控治療膀胱過度活動中的作用
　　目的：
　　研究GABAA，Glycine和Opioid受體在骶神經調控治療膀胱過度活動中的作用，以此來明確骶神經調控抑制膀胱過度活動癥(OAB)的神經調節(jié)機制。

9、　　方法：
　　1.手術過程
　　本實驗共用20只短耳貓，2-5％異氟烷吸入性麻醉成功后，進行氣管插管保持氣道通暢，右側頸總動脈置管用以記錄動脈血壓，雙側頭靜脈置管用以實驗過程中給予藥物和靜脈補液，將雙側輸尿管游離，一側結扎并剪斷，另一側連接橡膠管引流尿液，于尿道近端將雙腔導管插入膀胱，一側管腔與壓力傳感器相連接，用以監(jiān)測膀胱壓力(Cystometrogram，CMG)的變化，另一側管腔連接微量注射泵，用以灌注生理鹽水或者0

10、.5％乙酸(1-3ml/min)，游離骶1和骶2神經，連接電刺激器。取5只貓，在脊髓棘突L3水平處做椎板切除術。首先將脊髓完整暴露，然后將硬脊膜打開，在蛛網膜下腔處將細導管(PE10)向尾側方向插入，位置直至S1和S2水平，用做鞘內注射印防己毒素和納絡酮。在手術結束后靜脈注射a-氯醛糖（初始劑量65 mg/kg，后2mg/kg/h維持劑量）和泮庫溴銨（初始劑量0.1mg/kg，后0.1mg/kg/h維持劑量），用以保持動物處于持續(xù)麻醉和

11、肌肉松弛狀態(tài)。然后對膀胱進行壓力和容積測定以及骶神經電刺激研究。
　　2、骶神經電刺激的參數(shù)選擇
　　根據(jù)我們前期的研究提示，單相矩形脈沖電流(5HZ，0.2ms)可以有效的抑制膀胱的過度活動，在實驗開始后通過鉤狀電極刺激S1或者S2背根神經，當觀察到出現(xiàn)明顯的肛門括約肌或腳趾收縮的最小強度時，即為骶神經電刺激的閾值(Threshold，T)。測定閾值需在靜脈注射泮庫溴銨之前。
　　3、實驗過程及分組:
　　實驗

12、起初，用生理鹽水對每只貓進行膀胱灌注，當觀察到出現(xiàn)時間超過20秒，幅度大于30cmH20的收縮波時的膀胱容量，即為貓的初始膀胱容量。在獲得穩(wěn)定的初始膀胱容量后，緩慢向膀胱中灌注0.5％的乙酸，激發(fā)C傳入纖維活動，從而引起膀胱過度活動(OAB)。多次重復CMG，直至獲得相對穩(wěn)定的膀胱容量，此時的膀胱容量即為膀胱過度活動狀態(tài)下的膀胱容量。待膀胱穩(wěn)定后，進行骶神經刺激并觀察其對膀胱過度活動癥(OAB)的影響。重復以下4次CMG測定:(1) S

13、NM刺激前對照CMG，(2) S1 DRT刺激的CMG，(3) S2 DRT刺激的CMG，(4) SNM刺激后對照CMG，記錄不同狀態(tài)下的膀胱容量，以檢測骶神經刺激對OAB的影響及是否有刺激后效應。
　　本實驗共分為3組，第一組(N=9)給予累積劑量的GABAA受體拮抗體印防己毒素(0.01，0.03，0.1，0.3和1.0 mg/kg，i.v.).每次靜脈給藥后，等待10分鐘，然后重復上述CMG。第二組(N=6)給予累積劑量的甘

14、氨酸受體拮抗劑士的寧（0.001，0.003，0.01，0.03，0.1和0.3mg/kg，i.v.），在給予最后一個劑量的士的寧后，單次給予印防己毒素(0.3 mg/kg，iv)。每次靜脈給藥后，等待10分鐘，然后重復上述CMG。第三組(N=5)先給予鞘內注射印防己毒素(單一劑量0.4mg)，然后給予鞘內注射阿片類受體拮抗劑納絡酮（單一劑量0.3mg），每次鞘內注射后，等待5分鐘，然后重復上述CMG。每做完一次CMG，等待2-3分鐘再

15、進行下一個CMG，以保證膀胱徹底松弛。
　　4、統(tǒng)計分析
　　將實驗動物每次測得膀胱容量與同一只貓的初始膀胱容量的比值(％)，即為膀胱容量百分比，這是一標準化比值，有利于不同動物之間的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。不同動物之間的統(tǒng)計結果采用平均值±標準誤的方式表示。采用Student t檢驗進行兩組間均數(shù)的對比，Bonferroni多重比較進行組內和組間的差異性檢驗。我們的統(tǒng)計分析結果，采用的是GraphPad Prism4統(tǒng)計軟件，將

16、P值小于0.05標記為具有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1.S1或S2背根神經刺激明顯抑制膀胱過度活動
　　膀胱內灌注生理鹽水測的初始膀胱容量標準化后值為100.2±0.59％，灌注0.5％乙酸后，膀胱容量明顯降低至59.5±4.8％(P＜0.01)，表明乙酸成功激發(fā)C傳入纖維，誘導膀胱過度活動。給予引起肛門括約肌收縮或者腳趾收縮的強度的骶1或骶2背根神經刺激，明顯增加膀胱容量至105.3±9.2％和134.8±8.9

17、％(P＜0.01)。刺激后膀胱容量恢復至刺激前水平，提示無刺激后效應。
　　2.靜脈注射印防己毒素在骶神經調控抑制膀胱活動中的作用
　　靜脈注射印防己毒素在0.3-1.0mg/kg劑量時可以輕微的增加刺激前膀胱容量，但是這一增加沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05).在0.3mg/kg(P＜0.05)劑量時可以明顯阻斷骶1背根神經刺激的抑制作用，但無法消除骶2背根神經刺激的抑制作用。但是，在1.0mg/kg(P＜0.05)劑量時可以

18、完全阻斷骶1和骶2背根神經刺激的抑制作用，在刺激后，膀胱容量恢復至刺激前水平，提示無刺激后效應。
　　3.聯(lián)合靜脈注射士的寧和印防己毒素對骶神經調控抑制膀胱過度活動的影響
　　靜脈注射士的寧在0.03-0.3mg/kg時可以顯著增加刺激前膀胱容量，并且沒有影響骶1和骶2背根神經刺激的抑制作用。在給予累積劑量0.3mg/kg士的寧后，給予一次性劑量的印防己毒素(0.3mg/kg)，可以明顯增加刺激前膀胱的容量(P＜0.05)，

19、同時消除了骶1和骶2背根神經刺激的抑制效應。然而，在沒有士的寧的前期治療下的相同劑量的印防己毒素(0.3mg/kg)只能消除骶1背根神經刺激的抑制效應，而對骶2背根神經刺激的抑制效應無作用。刺激后膀胱容量恢復至刺激前水平，表明無刺激后效應。
　　4.鞘內注射印防己毒素和納絡酮對骶神經調控抑制膀胱過度活動的影響
　　鞘內注射單一劑量印防己毒素(0.4mg)沒有明顯改變刺激前膀胱容量，并且沒有影響骶1和骶2背根神經刺激的抑制作用

20、。但是，骶神經刺激后膀胱容量明顯增加(P＜0.05)，表明出現(xiàn)明顯的刺激后效應。然后在此基礎之上，給予單一劑量納絡酮(0.3mg)，不僅顯著降低了刺激前膀胱容量(P＜0.05)，而且消除了骶神經刺激后效應(P＜0.05)。但是，即使我們鞘內注射了印防己毒素和納絡酮，骶1和骶2背根神經依然具有顯著的抑制作用(P＜0.05)。
　　結論：
　　GABAA受體在骶神經調控膀胱過度活動中發(fā)揮重要的作用，并且在脊髓之上的位置發(fā)揮作用;

21、甘氨酸受體的主要作用體現(xiàn)在興奮GABAA受體的抑制作用;阿片類受體主要調控抑制脊髓GABAA受體后激發(fā)的刺激后效應。
　　第二部分:大麻素受體Ⅰ型在脛神經和陰部神經電刺激治療膀胱過度活動中的作用
　　目的：
　　研究大麻素受體Ⅰ型在脛神經和陰部神經電刺激治療膀胱過度活動中發(fā)揮的作用，以此明確脛神經和陰部神經調控膀胱過度活動癥(OAB)的神經調節(jié)機制。
　　方法：
　　1.手術過程
　　本部分實驗共應用

22、17只短耳貓，2-5％異氟烷吸入性麻醉成功后，進行氣管插管保持氣道通暢，右側頸總動脈置管用以記錄動脈血壓，雙側頭靜脈置管用以實驗過程中給予藥物和靜脈補液，將雙側輸尿管游離，一側結扎并剪斷，另一側連接橡膠管引流尿液，于尿道近端將雙腔導管插入膀胱，一側管腔與壓力傳感器相連接，用以監(jiān)測膀胱壓力(Cystometrogram，CMG)的變化，另一側管腔連接微量注射泵，用以灌注生理鹽水或者0.5％乙酸(1-3ml/min)，分離左側脛神經和右側陰

23、部神經，袖套式電極包裹后連接刺激器。取5只貓，在脊髓棘突L3水平處做椎板切除術。首先將脊髓完整暴露，然后將硬脊膜打開，在蛛網膜下腔處將細導管(PE10)向尾側方向插入，位置直至L7水平，用做鞘內注射AM251。在手術結束后靜脈注射a-氯醛糖（初始劑量65 mg/kg，后2mg/kg/h維持劑量）維持麻醉，對膀胱進行壓力和容積測定以及脛神經和陰部神經電刺激研究。
　　2、神經電刺激參數(shù)的選擇
　　根據(jù)我們前期的研究提示，單相矩

24、形脈沖電流(5HZ，0.2ms)可以明顯抑制膀胱的過度活動，通過袖套式電極對脛神經或陰部神經進行刺激，脛神經或陰部神經電刺激的閾值(Threshold，T)為觀察到明顯的腳趾或肛門括約肌收縮的最小強度。
　　3、實驗過程及分組:
　　首先，多次測定膀胱容量，直至獲得相對穩(wěn)定的初始膀胱容量。然后，通過微量注射泵以1-3ml/min的速度向膀胱內灌注0.5％的乙酸，激活C傳入纖維，從而誘導膀胱過度活動(OAB)。多次重復進行CM

25、G測定，當獲得相對穩(wěn)定的膀胱容量時，將其定義為膀胱過度活動條件下的膀胱容量。待膀胱穩(wěn)定后，進行脛神經電刺激(TNS)并觀察其對膀胱過度活動癥(OAB)的影響。重復以下4次CMG測定:(1)脛神經電刺激(TNS)前對照CMG，(2)脛神經電刺激強度為2T時即2T-TNS的CMG，(3)脛神經電刺激強度為4T時即4T-TNS的CMG，(4)脛神經電刺激(TNS)后對照CMG，記錄不同狀態(tài)下的膀胱容量，以檢測脛神經電刺激對OAB的影響及是否有

26、刺激后效應。陰部神經電刺激的操作過程同脛神經電刺激，即(1)刺激前對照CMG，(2)2T-PNS，(3)4T-PNS，(4)刺激后對照CMG
　　本實驗共分為4組，第一組(N=5)，給予累積劑量的大麻素受體Ⅰ型拮抗劑AM251(0.01，0.03，0.1，0.3和1.0 mg/kg，i.v.).給予完每個劑量的藥物后，給予10分鐘等待時間，然后進行上述脛神經電刺激CMG測定。由于AM251需要溶解在30％的聚氧乙烯蓖麻油(Crem

27、ophor)，因此在第二組實驗(N=5)中，給予與AM251相同的累積劑量的載體溶劑對照(0.01，0.03，0.1，0.3和1.0 mg/kg，i.v.30％的Cremophor溶解于生理鹽水中)，同第一組實驗方案，給藥后等待10分鐘，然后重復上述脛神經電刺激CMG。第三組（N=5，其中三只動物取自載體溶劑對照組），給予鞘內注射AM251(單一劑量0.03mg)，給藥后等待5分鐘，然后重復上述脛神經電刺激CMG。第四組(N=5)，給予

28、累積劑量的大麻素受體Ⅰ型拮抗劑AM251(0.01，0.03，0.1，0.3和1.0 mg/kg，i.v.).給予完每個劑量的藥物后，給予10分鐘的等待時間，然后進行上述陰部神經電刺激CMG測定。每做完一次CMG，等待2-3分鐘再進行下一個CMG，以保證膀胱徹底松弛。
　　4、統(tǒng)計分析
　　將實驗動物每次測得膀胱容量與同一只貓的初始膀胱容量的比值(％)，即為膀胱容量百分比，這是一標準化比值，有利于不同動物之間的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分

29、析。不同動物之間的統(tǒng)計結果采用平均值±標準誤的方式表示。采用Two-wayANOVA(Bonferroni)和One-way ANOVA(Dunnett's)進行組間和組內的多重比較。我們的統(tǒng)計分析結果，采用的是GraphPad Prism4統(tǒng)計軟件，將P值小于0.05標記為具有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1.脛神經電刺激可以明顯抑制膀胱的過度活動
　　膀胱內灌注生理鹽水測的初始膀胱容量標準化后值為100.1±0.2

30、7％，灌注0.5％乙酸后，膀胱容量明顯降低至36.6±4.8％(P＜0.01，N=12)，表明乙酸成功激發(fā)C傳入纖維，誘導膀胱過度活動。給予引起腳趾收縮的強度的2T TNS和4TTNS刺激后，明顯增加膀胱容量至69.2±9.7％和79.5±7.2％(P＜0.01)。刺激后膀胱容量恢復至刺激前水平，提示無刺激后效應。
　　2.靜脈注射AM251在脛神經和陰部神經電刺激抑制膀胱活動中的作用
　　靜脈注射AM251在降低脛神經電刺

31、激抑制膀胱過度活動的同時并沒有改變刺激前的膀胱容量。AM251分別在0.03mg/kg和0.1mg/kg時明顯降低2T強度和4T強度的脛神經電刺激的抑制作用(P＜0.05)。載體溶劑（30％的Cremophor溶解與鹽水中）對照組對于脛神經電刺激的抑制作用以及刺激前的膀胱容量都沒有作用。0.03mg AM251鞘內注射對脛神經電刺激的抑制作用以及刺激前的膀胱容量都沒有作用，這一結果表明，藥物的作用部位并不在第7腰椎。0.01-1.0mg