用原子力顯微鏡（AFM）進(jìn)行蛋白質(zhì)晶體生長(zhǎng)及成核研究.pdf

1、生物大分子(包括蛋白質(zhì)、核酸和病毒等)對(duì)生物體的生命活動(dòng)起著十分重要的作用，這是由它們具有特殊的空間結(jié)構(gòu)所致。隨著生物學(xué)領(lǐng)域?qū)_的生物大分子結(jié)構(gòu)需求的日益增加，尤其是利用單晶X射線衍射法得到的三維結(jié)構(gòu)，使得研究生物大分子晶體的生長(zhǎng)越來(lái)越受到重視。然而，生物大分子的結(jié)晶相當(dāng)困難，從某種意義上講這是生物大分子結(jié)構(gòu)測(cè)定的限速因素。目前對(duì)生物大分子的晶體生長(zhǎng)機(jī)理、成核的過(guò)程、基本的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)參數(shù)等的認(rèn)識(shí)很少，所以在晶體的缺陷、分子在晶格中

2、的定向力和分子間鍵連作用以及溶液中傳質(zhì)過(guò)程方面的認(rèn)識(shí)也很有限。因此，進(jìn)行的生物大分子晶體生長(zhǎng)的研究就顯得非常必要。目前已有一些技術(shù)應(yīng)用于研究生物大分子晶體的生長(zhǎng)機(jī)理中，如光散射技術(shù)(QELS)和原子力顯微鏡(AFM)等，而迄今為止，AFM仍為進(jìn)行這一研究的非常重要的工具。 本論文通過(guò)AFM實(shí)驗(yàn)主要進(jìn)行了部分蛋白質(zhì)晶體的生長(zhǎng)過(guò)程的研究，包括杜仲抗真菌蛋白(Eucommiaantifungalprotein，簡(jiǎn)稱EAFP)、天花粉蛋

3、白(Trichosanthin，簡(jiǎn)稱TCS)、天麻抗真菌蛋白(Gastrodiaelataantifungalprotein，簡(jiǎn)稱GAFP)，并取得了一定進(jìn)展，有一些新的發(fā)現(xiàn)： 1.EAFP在其水溶液中能形成一種環(huán)狀聚集體，在40mg/ml的高濃度時(shí)其直徑大小從100nm到300nm左右，而在低濃度(5mg/m/l)時(shí)只有10-25nm左右，且數(shù)量較少。有的形成一個(gè)完整的環(huán)，有的環(huán)正在形成。這說(shuō)明EAFP分子間本身有著較強(qiáng)的相互

4、作用，能自發(fā)地在水溶液中進(jìn)行聚集，且隨溶液的濃度變小而聚集能力降低。 2.EAFP晶體的生長(zhǎng)速度很快，通常只需要數(shù)小時(shí)就可長(zhǎng)到較大尺寸(約1mm)，要比普通的蛋白質(zhì)晶體生長(zhǎng)快很多倍，而且沿著晶體學(xué)軸向的生長(zhǎng)速率也各不相同，表現(xiàn)出明顯的各向異性；且生長(zhǎng)的速率還與蛋白質(zhì)溶液的過(guò)飽和度密切相關(guān)，過(guò)飽和度較高時(shí)(大于1.78)生長(zhǎng)極為快速，難以進(jìn)行速率的測(cè)量；當(dāng)過(guò)飽和度為1.45時(shí)，EAFP晶體的{100}面上的生長(zhǎng)速率b方向上平均為1

5、2nm/s，c方向上平均為24.2nm/s；當(dāng)過(guò)飽和度為1.15時(shí)，其生長(zhǎng)速率b方向上為4.1nm/s；c方向上為8.8nm/s，而此時(shí)，其生長(zhǎng)速率仍與報(bào)道的其他蛋白質(zhì)晶體生長(zhǎng)速率基本相當(dāng)，這些都說(shuō)明EAFP晶體具有很快的生長(zhǎng)速率。 3.實(shí)時(shí)原位AFM研究EAFP單斜晶體{100}面的生長(zhǎng)過(guò)程結(jié)果表明EAFP晶體生長(zhǎng)并非以單一的生長(zhǎng)模式進(jìn)行，而是隨生長(zhǎng)條件的變化采取不同的生長(zhǎng)特征，有以下因素可能與EAFP的晶體快速生長(zhǎng)機(jī)制相關(guān)：

6、①多重不對(duì)稱二維島堆垛生長(zhǎng)源；②活潑的不對(duì)稱螺旋錯(cuò)位生長(zhǎng)源(主要以不對(duì)稱的雙左旋為主，以不斷出現(xiàn)的多個(gè)無(wú)規(guī)的右旋為次)；③臺(tái)階按編組生長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)特性。 4.EAFP在低過(guò)飽和度下的螺旋生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)臺(tái)階的合并，從而表現(xiàn)出單-雙的螺旋臺(tái)階，在小范圍掃描中捕獲到了這種現(xiàn)象，使得對(duì)螺旋生長(zhǎng)臺(tái)階的合并過(guò)程有了更加深入的認(rèn)識(shí)；并且臺(tái)階的生長(zhǎng)受到沿晶體學(xué)b軸方向上的21螺旋對(duì)稱的控制；當(dāng)臺(tái)階生長(zhǎng)至第八到第九層時(shí)，螺旋臺(tái)階會(huì)自動(dòng)地形成完整的生

7、長(zhǎng)層，這充分說(shuō)明了EAFP分子或分子簇具有良好的自身調(diào)節(jié)能力，這樣在晶體生長(zhǎng)過(guò)程中，晶體的缺陷減少，晶體質(zhì)量提高，這也可說(shuō)明EAFP晶體的x射線衍射能力很強(qiáng)的原因。 5.通過(guò)對(duì)EAFP晶體中各種相互作用分析表明：一個(gè)EAFP分子與周圍的相鄰分子間有218個(gè)殘基間的相互作用，其中有18個(gè)是強(qiáng)的相互作用，有72個(gè)較強(qiáng)作用(間距小于4埃)，這些作用大部分與晶體學(xué)c方向上的作用相關(guān)，說(shuō)明在c方向上作用較強(qiáng)。由于這種差別，使得EAFP在結(jié)

8、晶過(guò)程中，當(dāng)分子受到不同方向上的作用力時(shí)，便形成了表面形貌的不對(duì)稱，進(jìn)而影響到晶體的外貌。另外，通過(guò)大分子結(jié)構(gòu)分析XPLOR(NIH版)對(duì)EAFP在溶液中和在晶格中的分子能量的較為詳盡的分析表明，盡管兩種狀態(tài)下的EAFP分子骨架差別不大(主要是側(cè)鏈Arg殘基伸展方向不同)，但晶格中的EAFP分子采用較為有利的構(gòu)象，使結(jié)晶過(guò)程能夠順利進(jìn)行；且沿結(jié)晶學(xué)不同方向上分子間的相互作用能(尤其是氫鍵能的差別)也不同，沿c方向上要比沿b方向上強(qiáng)約1/

9、3，這也與AFM結(jié)果分析相一致。 6.發(fā)現(xiàn)天花粉晶體所有表面上沒有螺旋位錯(cuò)或臺(tái)階生長(zhǎng)，只在其{001}面上發(fā)現(xiàn)明顯的非對(duì)稱線性的3D核進(jìn)行生長(zhǎng)。這些線性聚體均沿著晶體學(xué)〈110〉的方向進(jìn)行排列，而且相互平行，這可說(shuō)明天花粉分子間在這個(gè)方向上有著較強(qiáng)的相互作用，使得分子沿著這個(gè)方向容易進(jìn)行聚集；對(duì)于GAFP晶體，原位實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)的原子力顯微成像初步的研究發(fā)現(xiàn)在其晶體的{001}表面晶體生長(zhǎng)較為緩慢，沒有發(fā)現(xiàn)臺(tái)階和螺旋位錯(cuò)生長(zhǎng)現(xiàn)象，而是