聚集體的狀態(tài)對蛋白質(zhì)晶體生長的影響.pdf

1、尋找蛋白質(zhì)晶體生長的優(yōu)化條件一直是晶體生長工作者的目標，但是不同的蛋白質(zhì)有著不同的生長條件，很難提出某種完全適應(yīng)于所有蛋白質(zhì)的晶體生長條件以及判斷晶體能否生長的標準。對于判斷晶體能否生長的研究比較少而且絕大多數(shù)集中在對成核后期的研究上，很少有對成核前期研究的報道。而成核前溶液中蛋白質(zhì)形成的聚集體的狀態(tài)(包括聚集體的大小，形貌，甚至于構(gòu)象等)的變化會直接影響到成核的情況。這是由于，在蛋白質(zhì)成核前出現(xiàn)的聚集體一般呈現(xiàn)出無序的聚集狀態(tài)，而形成

2、的晶核以及晶體生長中出現(xiàn)的聚集體，都是蛋白質(zhì)分子有序堆積而成。因此，對無序聚集體狀態(tài)的變化進行研究，有助于分析有序聚集體的出現(xiàn)條件并由此提供蛋白質(zhì)晶體生長的合適條件。 溶液中聚集體的狀態(tài)一般包括聚集體的大小和聚集體大小的分布兩類參數(shù)。此二類參數(shù)在晶體生長的過程的變化情況、它們對晶體生長的影響情況如何以及它們和溶液的溫度、濃度之間的聯(lián)系如何等是本工作研究的重點。主要利用光散射(DLS)和原子力顯微鏡(AFM)對刀豆蛋白A溶液的聚集

3、體進行研究。 分別研究了在蛋白質(zhì)晶體成核和生長階段蛋白質(zhì)溶液中聚集體的變化，以及聚集體的變化與晶體生長過程之間的內(nèi)在聯(lián)系。通過對比結(jié)晶和不結(jié)晶條件下聚集體的變化差異，以及聚集體狀態(tài)的變化與蛋白質(zhì)溶液的濃度、溫度和時間的關(guān)系，獲得了溶液中聚集體的狀態(tài)分別與晶體能否生長之間的聯(lián)系，探討了聚集體大小和分散度，對晶體生長的影響程度哪個更大。 在刀豆蛋白和沉淀劑溶液混合后一小時，我們用動態(tài)光散射儀測量了不同濃度(0.06-1.6m

4、g/ml)和不同溫度(15℃、20℃、25℃)下刀豆蛋白A溶液中聚集體大小的變化。每個樣品重復(fù)測量至少10次，結(jié)果用NNLS方法分析，取平均值。我們用一定濃度的刀豆蛋白A溶液加入沉淀劑0.7mg/mlNaCl溶液，在結(jié)晶和不結(jié)晶條件下做了連續(xù)六天的原子力顯微鏡實驗，可結(jié)晶條件下刀豆蛋白A的濃度為1.1mg/ml，不可結(jié)晶條件下刀豆蛋白A的濃度為0.2mg/ml。實驗時，蛋白質(zhì)溶液與沉淀劑溶液等體積混合。實驗溫度20℃，濕度為50～60％

5、，在硅片上吸附的時間為7min。 通過DLS實驗我們發(fā)現(xiàn)：在15℃時，隨著刀豆蛋白溶液濃度的增大，溶液中的聚集體大小由120nm逐漸減小，當濃度增大到0.79mg/ml后，聚集體大小保持在74nm左右不再變化。在20℃時，隨著刀豆蛋白溶液濃度的增大，溶液中的聚集體大小由111nm逐漸減小，當濃度增大到0.45mg/ml后，聚集體大小保持在74nm左右不再變化。同樣在25℃時，隨著刀豆蛋白溶液中濃度的增大，溶液中的聚集體大小由10

6、6nm逐漸減小，當濃度增大到0.84mg/ml后，聚集體大小保持在74nm左右。而在非晶體生長條件下，20℃時隨著濃度的增大聚集體的變化是雜亂無章的。由此可見，在刀豆蛋白晶體的適宜生長條件下，在生長溶液中，刀豆蛋白A溶液中的聚集體在成核階段前隨著溶液濃度的增大而減小，直至平均聚集體的大小不再變化，此時溶液中聚集體大部分都是第一類聚集體的形式存在。非生長溶液中，隨著濃度的增大，蛋白質(zhì)溶液中聚集體大小的變化是雜亂無章的。此外，通過對相應(yīng)條件

7、下聚集體的分散度對比分析發(fā)現(xiàn)，隨溶液濃度的增加，分散度呈現(xiàn)由單分散轉(zhuǎn)變?yōu)槎喾稚⒌内厔?，并且多分散度增長至一定大小后不再隨濃度的變化而變化，而且其變化的轉(zhuǎn)折點與聚集體大小變化的轉(zhuǎn)折點相一致。刀豆蛋白的這一分散度的變化趨勢和我們以前研究過的溶菌酶的變化趨勢是不相同的。 基于成核后的生長階段中聚集體的大小較大，相互作用較強，我們還采用了AFM研究了隨著生長過程的進行，刀豆蛋白溶液中聚集體的狀態(tài)變化情況。通過AFM觀察的所得圖片進行分析

8、我們發(fā)現(xiàn)，在結(jié)晶條件下，隨保存時間的增加(1-6天)，直徑大小在10-20nm區(qū)間的聚集體所占總聚集體數(shù)目的百分數(shù)呈降低趨勢，而在非結(jié)晶條件下，這一比例呈上升趨勢。說明晶體生長過程中，生長基元一直呈現(xiàn)消耗狀態(tài)。 基于以上實驗結(jié)果，我們得到的結(jié)論如下：刀豆蛋白的晶體生長過程中，在成核階段，溶液中主要的聚集體的大小會減小至第一類聚集體的大小，相應(yīng)地，聚集體也呈現(xiàn)多分散分布情況。聚集體的大小和分散度二者對于晶體生長的影響是完全不同的，

9、前者起決定性作用，后者則不起作用。溶液溫度的變化對成核階段的影響在一定程度上可以通過改變?nèi)芤哼_到過飽和時的濃度來體現(xiàn)，但其對溶液中聚集體的變化趨勢沒有本質(zhì)上的影響，即改變溫度時，聚集體隨蛋白質(zhì)濃度變化的趨勢基本不變，只是改變了聚集體達到穩(wěn)定大小時的蛋白質(zhì)溶液濃度的大小。在刀豆蛋白A的晶體生長階段，聚集體的大小也和晶體的生長密切相關(guān)。在晶體生長條件下，大小和生長基元一致的聚集體所占聚集體總數(shù)的比例隨生長時間的增加而逐漸降低；而在非結(jié)晶條件