發(fā)菜(Nostoc flagelliforme)不同生長(zhǎng)狀態(tài)差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、發(fā)菜是一種陸生固氮藍(lán)藻，主要分布于干旱-半干旱荒漠草原地區(qū)，是當(dāng)?shù)刂饕纳锕痰Y源和拓荒植物。本研究建立了發(fā)菜蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)，研究了日生長(zhǎng)周期中不同生長(zhǎng)狀態(tài)下的蛋白質(zhì)表達(dá)差異、干燥失水和恢復(fù)吸水狀態(tài)下的超微結(jié)構(gòu)、生理學(xué)和蛋白質(zhì)表達(dá)差異，克隆了與生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆相關(guān)的差異蛋白(Peroxiredoxin、Mn-CAT、Ferritin和Hypothetical proteinNXL-01)基因，進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，研究其原核表達(dá)，并

2、進(jìn)行了RT-PCR和Western blot驗(yàn)證。
　　 1發(fā)菜蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法的建立
　　 為建立適用于發(fā)菜蛋白質(zhì)組研究的雙向電泳技術(shù)，對(duì)發(fā)菜蛋白質(zhì)的提取、裂解、上樣量、IEF及SDS-PAGE電泳等關(guān)鍵步驟進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果顯示：發(fā)菜蛋白質(zhì)主要分布在pH4～7范圍內(nèi)，采用改良TCA法可提高提取液中蛋白質(zhì)的含量和雙向電泳圖譜的分辨率，裂解液含60 mmol/LDTT，上樣量1.3 mg/(24cm IPG膠條)時(shí)不僅提

3、高了蛋白質(zhì)的溶解性，而且改善了雙向電泳的分離效果，蛋白點(diǎn)清晰，圖譜分辨率較好。采用優(yōu)化后的雙向電泳體系提高了發(fā)菜蛋白質(zhì)雙向電泳的分辨率和重復(fù)性，建立起一套適用于發(fā)菜蛋白質(zhì)組分析的雙向電泳方法。
　　 利用雙向凝膠電泳(2-DE)技術(shù)，PDQuest軟件分析圖像，基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(MALDI-TOF-TOF/MS)分析得到肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)，通過(guò)MASCOT。和NCBI進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，初步建立了發(fā)菜蛋白質(zhì)

4、組學(xué)研究方法。從2-DE圖譜中選擇89個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行蛋白質(zhì)譜鑒定，共成功鑒定到68個(gè)蛋白點(diǎn)，代表44種蛋白，鑒定率為76.40％。57個(gè)蛋白點(diǎn)確定為數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的藍(lán)藻的蛋白，其中43個(gè)來(lái)源于已知的點(diǎn)形念珠藻的蛋白，7個(gè)來(lái)源于念珠藻PCC7120，2個(gè)來(lái)源于魚腥藻，3個(gè)來(lái)源于普通念珠藻，4個(gè)未鑒定出物種來(lái)源。另有3個(gè)蛋白點(diǎn)來(lái)源于其他物種。對(duì)發(fā)菜SOD的PMF和氨基酸序列進(jìn)行了分析，表明與普通念珠藻SOD的序列覆蓋率為41％。
　　

5、2發(fā)菜日生長(zhǎng)周期差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　 在生長(zhǎng)季節(jié)的日生長(zhǎng)周期中，早晨發(fā)菜凈光合速率與暗呼吸速率旺盛，固氮酶和谷氨酰胺合成酶活性高，氮代謝活躍；中午隨著氣溫升高，發(fā)菜失水干燥，光照強(qiáng)度加大，凈光合速率與暗呼吸速率均急劇下降，固氮酶和谷氨酰胺合成酶活性降低；下午，氣溫逐漸下降，光照強(qiáng)度逐漸減弱，發(fā)菜再次逐漸吸收少量空氣中的水分，凈光合速率與暗呼吸速率均小幅回升，固氮酶和谷氨酰胺合成酶活性回升。
　　 運(yùn)用2-DE對(duì)生長(zhǎng)季

6、節(jié)的日生長(zhǎng)周期中不同生長(zhǎng)狀態(tài)發(fā)菜差異蛋白分離進(jìn)行分離，在上午7:00的2-DE圖譜上共檢測(cè)到蛋白點(diǎn)1247個(gè)，下午13:00的2-DE圖譜上共檢測(cè)到蛋白點(diǎn)1164個(gè)，下午19:00的2-DE圖譜上共檢測(cè)到蛋白點(diǎn)1188個(gè)。3個(gè)時(shí)期2-DE圖譜的平均匹配率為71.32％。對(duì)3個(gè)時(shí)期2-DE圖譜Master膠進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，匹配的蛋白點(diǎn)較多集中在66.2-26.6kD，占總蛋白點(diǎn)數(shù)的68％，pH4.5～6之間，占總蛋白點(diǎn)數(shù)的83％。PDQuest

7、圖像軟件分析表明，有38個(gè)表達(dá)量差異在2倍以上蛋白點(diǎn)，其中18個(gè)差異蛋白呈下調(diào)表達(dá)，7個(gè)蛋白呈上調(diào)表達(dá)，13個(gè)蛋白先下調(diào)然后上調(diào)表達(dá)。MALDI-TOF-TOF/MS鑒定結(jié)果表明，有31個(gè)蛋白點(diǎn)被成功鑒定(鑒定率為81.58％)，可以分為6個(gè)功能類群，包括分泌和調(diào)節(jié)蛋白(15.79％)，抗氧化作用相關(guān)的蛋白(20.05％)，氮代謝相關(guān)的蛋白(10.53％)，能量和糖代謝相關(guān)的酶(10.53％)，細(xì)胞分裂相關(guān)蛋白(2.63％)，未知蛋白(

8、21.05％)等，另有7個(gè)蛋白點(diǎn)未鑒定成功(18.42％)。這些差異蛋白在發(fā)菜的生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆作用有中具有重要功能。
　　 3干燥和恢復(fù)吸水發(fā)菜超微結(jié)構(gòu)、生理和蛋白質(zhì)組學(xué)分析
　　 在發(fā)菜持續(xù)失水48 h，然后恢復(fù)吸水4 h條件下，形態(tài)和結(jié)構(gòu)分析表明，持續(xù)失水48h(48HAD)的發(fā)菜外表干燥、鄒縮，呈黑色，但藻體、藻絲體、膠鞘和細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，類囊體膜及細(xì)胞內(nèi)顆粒物質(zhì)無(wú)明顯變化，恢復(fù)吸水4 h后，藻體膨脹、呈藍(lán)綠色或棕褐

9、色，具有光澤，藻體、藻絲體、膠鞘和細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，但細(xì)胞內(nèi)液泡的數(shù)量和體積比干燥發(fā)菜細(xì)胞的要多；生理學(xué)分析表明，恢復(fù)吸水4 h后的發(fā)菜自由水含量、自由水/束縛水比值、凈光合活性、暗呼吸速率、RuBisCO活性、可溶性糖、O2、SOD、CAT、POD、固氮酶和谷氨酰胺合成酶活性顯著增加，而MDA、H2O2、氨、脯氨酸、谷氨酸鹽含量明顯下降；比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明，與失水-復(fù)吸水密切相關(guān)的32個(gè)蛋白被鑒定，包括分泌蛋白(2.38％)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

10、(2.38％)、轉(zhuǎn)錄和翻譯(4.76％)、抗氧化過(guò)程(11.90％)、氮代謝(9.52％)、碳和能量代謝(11.90％)、脂代謝(2.38％)、分子伴侶(4.76％)、未知蛋白(28.57％)和沒(méi)有鑒定成功蛋白(21.43％)?；谛螒B(tài)結(jié)構(gòu)、生理和蛋白質(zhì)組學(xué)分析，表明隨著干燥失水和恢復(fù)吸水，發(fā)菜的生長(zhǎng)發(fā)育呈現(xiàn)靜止休眠與復(fù)蘇生長(zhǎng)交替進(jìn)行，在干燥條件下，生理代謝減弱，生長(zhǎng)緩慢甚至停止，而當(dāng)恢復(fù)吸水，代謝水平上調(diào)，生理活性增強(qiáng)，生長(zhǎng)啟動(dòng)甚至加

11、速。形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理和蛋白質(zhì)組分的變化體現(xiàn)了發(fā)菜對(duì)特殊生態(tài)環(huán)境的適應(yīng)。
　　 4發(fā)菜生長(zhǎng)與耐旱相關(guān)差異蛋白基因克隆與原核表達(dá)
　　 通過(guò)分析發(fā)菜過(guò)氧化物氧還蛋白(Peroxiredoxin)、錳過(guò)氧化氫酶(Mn-CAT)、鐵氧還蛋白(Ferritin)和Hypothetical protein NXL-01在不同生長(zhǎng)狀態(tài)及持續(xù)干燥48 h和復(fù)吸水4 h后的差異表達(dá)水平，根據(jù)鑒定的已知氨基酸序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并性引物克隆基因并進(jìn)行生

12、物信息學(xué)分析，研究克隆基因的原核表達(dá)和分子驗(yàn)證。結(jié)果表明：
　　 (1)根據(jù)簡(jiǎn)并性引物克隆獲得長(zhǎng)度為639 bp的過(guò)氧化物氧還蛋白基因，GenBank登陸號(hào)為BankIt1373957(HM854286)；693 bp的錳過(guò)氧化氫酶基因，GenBank登陸號(hào)為BankIt1311043(GU549477)；540 bp的鐵氧還蛋白基因，GenBank登陸號(hào)為BanIt1373981(HM854287)；327 bp的Hypoth

13、etical protein NXL-01基因，GenBank登陸號(hào)為BankIt1374705(HM854288)。
　　 (2)生物信息學(xué)分析表明：
　　 ①過(guò)氧化物氧還蛋白、錳過(guò)氧化氫酶、鐵氧還蛋白和Hypothetical protein NXL-01序列比較分析顯示該基因具有較高的保守性。
　　 ②過(guò)氧化物氧還蛋白在第194的Pro親水性最強(qiáng)，第122位的Arg疏水性最強(qiáng)；錳過(guò)氧化氫酶在第206的Gly

14、親水性最強(qiáng)，第96位的Val疏水性最強(qiáng)；鐵氧還蛋白在第128的Asp和129位的Glu親水性最強(qiáng)，第28位的Tyr疏水性最強(qiáng)；Hypothetical protein NXL-01在第101位的Glu親水性最強(qiáng)，第12位的Gly疏水性最強(qiáng)。
　　 ③過(guò)氧化物氧還蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α螺旋、β折疊和隨機(jī)卷曲構(gòu)成；錳過(guò)氧化氫酶二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α螺旋、β折疊和隨機(jī)卷曲構(gòu)成；鐵氧還蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α螺旋和隨機(jī)卷曲構(gòu)成；Hypothetic

15、al protein NXL-01二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α螺旋和隨機(jī)卷曲構(gòu)成。
　　 ④蛋白跨膜區(qū)分析表明過(guò)氧化物氧還蛋白、錳過(guò)氧化氫酶、鐵氧還蛋白和Hypotheticalprotein NXL-01為膜外蛋白。
　　 ⑤過(guò)氧化物氧還蛋白的Ser有5個(gè)磷酸化位點(diǎn)，Thr有6個(gè)磷酸化位點(diǎn)，Tyr有2個(gè)磷酸化位點(diǎn)；錳過(guò)氧化氫酶的Ser有3個(gè)磷酸化位點(diǎn)，Thr有1個(gè)磷酸化位點(diǎn)，Tyr有2個(gè)磷酸化位點(diǎn)；鐵氧還蛋白的Ser有1個(gè)磷酸化位

16、點(diǎn)，Thr有2個(gè)磷酸化位點(diǎn)，Tyr有1個(gè)磷酸化位點(diǎn)；Hypotheticalprotein NXL-01的Ser有5個(gè)磷酸化位點(diǎn)，Thr有1個(gè)磷酸化位點(diǎn)。
　　 (3)將過(guò)氧化物氧還蛋白、錳過(guò)氧化氫酶、鐵氧還蛋白和Hypothetical protein NXL-01基因在大腸桿菌中表達(dá)，分別獲得一個(gè)約26.5 kD、26 kD、22.4 kD和12.4 kD的外源蛋白。
　　 (4)對(duì)過(guò)氧化物氧還蛋白和錳過(guò)氧化氫酶基因

17、在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白進(jìn)行Westernblotting驗(yàn)證，表明外源蛋白為過(guò)氧化物氧還蛋白和錳過(guò)氧化氫酶。
　　 (5)RT-PCR分析表明，在日生長(zhǎng)周期的不同狀態(tài)下，錳過(guò)氧化氫酶基因、過(guò)氧化物氧還蛋白基因和鐵氧還蛋白基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上具有同樣表達(dá)差異，而均Hypothetical protein NXL-01基因在轉(zhuǎn)錄水平上無(wú)明顯差異；在干燥和復(fù)吸水狀態(tài)下，過(guò)氧化物氧還蛋白基因、錳過(guò)氧化氫酶基因、鐵氧還蛋白基因和Hypo