人脂肪干細胞在納米細菌纖維素膜上成骨分化的實驗研究.pdf

1、研究目的
　　 通過研究hASCs和BC膜的生物相容性，以及前者向成骨方向誘導分化的特性來初步探討hASCs和BC作為骨組織工程種子細胞和支架材料的可行性。
　　 研究方法
　　 1.hASCs傳代培養(yǎng)；
　　 2.掃描電鏡（SEM）觀察BC膜超微結構；
　　 3.倒置顯微鏡觀察hASCs的生長形態(tài)特征；
　　 4.CCK-8檢測hASCs在BC膜上的增殖；
　　 5.冰凍切片/H

2、E染色，及SEM觀察hASCs在BC膜上的粘附；
　　 6.倒置顯微鏡觀察hASCs成骨誘導分化過程中的生長形態(tài)特征；
　　 7.Von Kossa染色、茜素紅染色、堿性磷酸酶（ALP）染色檢測hASCs的成骨誘導分化；
　　 8.RT-PCR檢測hASCs在不同培養(yǎng)條件下成骨誘導分化中成骨標志物Osteopontin（OPN）、Osteocalcin（OC）、和ALP的表達產物，電泳后測條帶灰度，計算OC/GA

3、PDH、OPN/GAPDH和ALP/GAPDH灰度的比值代表以上基因的相對表達量；
　　 9.分別比較OPN、OC、ALP基因在不同培養(yǎng)條件下的表達差異；分析上述三種基因表達相互之間的聯(lián)系。
　　 研究結果
　　 1.大體上BC膜呈乳白色半透明膠狀，外表均勻光滑；掃描電鏡下可見細菌纖維素膜呈超微細網狀結構，呈現(xiàn)出良好的納米纖維網絡特征；
　　 2.hASCs在細菌纖維素膜表面貼附后呈長梭形，隨著時間延長，

4、細菌纖維素膜表面細胞數(shù)量逐漸增多，形態(tài)仍然保持長梭形。到9d時細胞融合成片；
　　 3.hASCs-BC膜復合培養(yǎng)物冰凍切片及HE染色可見細胞呈續(xù)的單層貼附生長于細菌纖維素膜表面，接觸緊密，且未見hASCs長入材料內部；
　　 4.掃描電鏡觀察可見hASCs呈長梭形，邊緣伸出突觸，貼附于細菌纖維素膜生長；
　　 5.hASCs在細菌纖維素膜表面的增殖良好，細胞對數(shù)生長期約在3-9天；
　　 6.脂肪間質干

5、細胞成骨分化過程中剛貼壁時仍呈長梭形或橢圓形，之后細胞形態(tài)逐漸開始出現(xiàn)短梭形和多角形等。隨著誘導時間的延長，由梭形變?yōu)榱⒎叫?、錐形，并有明顯胞漿突出，出現(xiàn)多角形成骨樣細胞，胞質顏色變深，含粗大顆粒，胞核明顯從胞漿伸出許多絲狀偽足，并可見明顯不透光礦化結節(jié)；
　　 7.在誘導培養(yǎng)基的條件下，細胞von Kossa染色hASCs在細胞培養(yǎng)板和BC膜上均呈現(xiàn)陽性反應，細胞內大可見量的黑色的礦化物質存在。普通干細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的條件下均呈

6、陰性反應。且同樣培養(yǎng)基條件下組間大體上無明顯差異；
　　 8.在誘導培養(yǎng)基的條件下，細胞茜素紅染色hASCs在細胞培養(yǎng)板和BC膜上均呈現(xiàn)陽性反應，可見大量的呈現(xiàn)桔紅色的鈣沉積陽性細胞。普通干細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的條件下均呈陰性反應。且同樣培養(yǎng)基條件下組間大體上無明顯差異；
　　 9.在誘導培養(yǎng)基的條件下，ALP染色hASCs在細胞培養(yǎng)板和BC膜上均呈現(xiàn)陽性反應，可見明顯的染成監(jiān)黑色的胞漿，細胞核為深藍色。普通干細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的

7、條件下BC膜組細胞胞漿似見較弱的藍染；
　　 10.RT-PCR檢測成骨相關基因表達結果顯示：第2周（依次為：0.89±0.09；0.72±0.12；0.43±0.06；0.47±0.05）和第4周（依次為：1.51±0.10；1.47±0.12；1.20±0.15；1.18±0.09）所有細胞均有ALP表達，但成骨誘導分化組明顯高于普通培養(yǎng)基組（P<0.001）。OC和OPN在第2周均無明顯表達，在第4周OPN有較明顯的表達（

8、依次為：0.51±0.09；0.48±0.07；0.11±0.030.10±0.02），OC微弱表達（依次為：0.33±_0.09；0.30±0.12；0.12±0.06；0.10±0.05）且同樣培養(yǎng)基條件下組間無明顯統(tǒng)計學差異（P>0.05）；
　　 11.成骨誘導過程中OC、OPN和ALP表達之間存在較強的正相關性（分別為：r=0.998，P=0.002：r=0.959，P=0.04；r=0.965，P=0.04）。

9、>　　 研究結論
　　 1.細菌纖維素膜具有獨特的納米超微結構，hASCs能在其表面良好的增殖和貼附，具有良好的生物相容性；
　　 2.利用含抗壞血酸、β-甘油磷酸和地寨米松的誘導培養(yǎng)基能將hASCs在普通細胞平板上成功的進行成骨誘導分化：
　　 3.利用含抗壞血酸、β-甘油磷酸和地塞米松的誘導培養(yǎng)基能將hASCs在細胞纖維素膜上成功的進行成骨誘導分化；
　　 4.成骨誘導過程中，hASCs形態(tài)發(fā)生明顯