MiR-21,-miR-145在機(jī)械牽張力調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞生物學(xué)功能中的作用及分子機(jī)制.pdf

1、研究背景
　　 血管長期暴露于搏動(dòng)性血流的作用下，后者產(chǎn)生的機(jī)械生物力對(duì)于正常的血管結(jié)構(gòu)和功能的維持具有關(guān)鍵作用。血管中的搏動(dòng)性血流主要產(chǎn)生兩種形式的機(jī)械生物力，分別是平行于血管長軸的剪切力(shearstress)和垂直于血管長軸的機(jī)械牽張力(stretchstress)。內(nèi)皮細(xì)胞襯于血管最里面，直接與血流接觸，因此剪切力主要作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞。而牽張力主要是由于心臟周期性搏動(dòng)引起的血管擴(kuò)張產(chǎn)生的，因此作用于血管各層細(xì)胞，但血

2、管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)是其主要的靶細(xì)胞。
　　 大量的體內(nèi)外研究證實(shí)，機(jī)械牽張力調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移以及表型等生物學(xué)功能。一般認(rèn)為，在正常情況下牽張力(9％～12％elongation)抑制平滑肌細(xì)胞的增殖、凋亡等功能，對(duì)于維持血管平衡具有重要調(diào)節(jié)作用，而在高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等病理情況下，異常增高的牽張力(＞15％elongation)則促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡等功能，誘導(dǎo)正常的血管結(jié)構(gòu)改變和功能失

3、調(diào)。近年來國內(nèi)外學(xué)者對(duì)機(jī)械牽張力調(diào)控平滑肌細(xì)胞生物學(xué)功能的分子機(jī)制做了深入研究，認(rèn)為細(xì)胞表面具有力學(xué)信號(hào)感受作用的各種分子可以將胞外的機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)化為胞內(nèi)的化學(xué)信號(hào)，通過激活一系列的信號(hào)通路和轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)各種基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞生物學(xué)功能改變。但是目前對(duì)這一機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的諸多機(jī)制尚不清楚，比如細(xì)胞表面是否存在特異性的力學(xué)信號(hào)感受分子，細(xì)胞內(nèi)各信號(hào)分子之間的相互作用模式，以及在轉(zhuǎn)錄水平之外的基因表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制等。進(jìn)一步深入了解牽張

4、力調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的分子機(jī)制，對(duì)于尋找新的高血壓、冠心病等心血管疾病干預(yù)靶點(diǎn)具有重要的意義。
　　 microRNAs(miRNAs)是一類內(nèi)源性的非編碼小RNA分子，通過抑制靶基因的翻譯或促進(jìn)mRNA的降解在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控基因表達(dá)。研究證實(shí)，miRNAs在心血管系統(tǒng)的正常發(fā)育以及多種病理過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs也參與機(jī)械生物力調(diào)節(jié)血管細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)，與靜止培養(yǎng)相比，剪切力誘導(dǎo)多個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞miRNA

5、s表達(dá)改變，其中miR-19a與miR-23b在剪切力調(diào)控細(xì)胞周期中發(fā)揮關(guān)鍵作用，miR-92a介導(dǎo)剪切力對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞NO的水平的調(diào)控。但是關(guān)于牽張力對(duì)血管細(xì)胞miRNAs表達(dá)的影響，以及后者在牽張力介導(dǎo)的細(xì)胞生物學(xué)功能中的作用目前還不清楚。
　　 miR-21是近年廣泛研究的一種miRNA，其在多種實(shí)體腫瘤細(xì)胞中表達(dá)升高，具有顯著的促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡作用。此外，miR-21在血管細(xì)胞中也有豐富表達(dá)，并且在損傷血管中表達(dá)上

6、調(diào)，促進(jìn)新生內(nèi)膜的形成。新近的研究發(fā)現(xiàn)，miR-21在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)受到剪切力的調(diào)節(jié)，并且不同形式的剪切力對(duì)miR-21表達(dá)的影響是不同的，miR-21分別在剪切力介導(dǎo)的內(nèi)皮炎癥、NO生成中發(fā)揮重要調(diào)控作用。miR-21在血管平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)豐度明顯高于內(nèi)皮細(xì)胞中，鑒于miR-21在細(xì)胞增殖、凋亡調(diào)節(jié)中的作用以及機(jī)械牽張力對(duì)平滑肌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，我們推測牽張力可能通過調(diào)節(jié)miR-21在血管平滑肌細(xì)胞中的水平影響細(xì)胞功能。目前對(duì)

7、miRNAs的研究多集中在其生物學(xué)效應(yīng)方面，而對(duì)miRNAs本身的表達(dá)調(diào)控機(jī)制知之甚少，miR-21基因位于蛋白編碼基因之間，具有獨(dú)立的啟動(dòng)子區(qū)域，研究發(fā)現(xiàn)AP-1，NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子可能參與miR-21表達(dá)調(diào)控，但是在牽張力的作用下，參與調(diào)節(jié)miR-21表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子尚不明確。深入了解miRNAs的表達(dá)調(diào)控機(jī)制有利于系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)牽張力調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞功能的分子機(jī)制，因此，在本研究中我們也初步探討牽張力調(diào)節(jié)miR-21表達(dá)的上游分子機(jī)

8、制。
　　 研究目的
　　 1.在體外細(xì)胞水平，明確牽張力對(duì)血管平滑肌細(xì)胞miR-21表達(dá)的影響。
　　 2.明確miR-21在牽張力介導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖與凋亡中的作用。
　　 3.明確牽張力調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞miR-21表達(dá)的分子機(jī)制。
　　 研究方法
　　 1.人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HASMCs)培養(yǎng)
　　 HASMCs細(xì)胞株購自美國ScienCell公司，細(xì)胞生長至完全融合

9、后，吸去培養(yǎng)基，用PBS沖洗細(xì)胞一遍以去除殘留的血清，然后加入適量預(yù)熱的0.25％胰蛋白酶，在顯微鏡下觀察到細(xì)胞細(xì)胞變圓后，吸去胰酶，加入新的平滑肌細(xì)胞完全培養(yǎng)基吹打均勻，轉(zhuǎn)入新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶放入含5％CO2的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
　　 2.機(jī)械牽張力干預(yù)體外培養(yǎng)的HASMCs
　　 接種HASMCs至鋪有Ⅰ型鼠尾膠原的Flexcell6孔板中(105細(xì)胞/孔)，待細(xì)胞生長至80％～90％融合時(shí)，利用無血清培養(yǎng)基誘

10、導(dǎo)培養(yǎng)24小時(shí)后，更換新的完全培養(yǎng)基或無血清培養(yǎng)基，使用Flexcell-5000細(xì)胞牽張力儀給予HASMCs不同強(qiáng)度的牽張力刺激，分組如下:
　　 (1)10％牽張力組:分別給予最大牽拉強(qiáng)度為10％，頻率為1Hz的周期性牽張力分別刺激細(xì)胞0、3、6、12、24小時(shí)。
　　 (2)16％牽張力組:分別給予最大牽拉強(qiáng)度為16％，頻率為1Hz的周期性牽張力分別刺激細(xì)胞0、3、6、12、24小時(shí)。
　　 3.實(shí)時(shí)熒光定

11、量PCR檢測miR-21表達(dá)水平
　　 使用Invitrogen公司的Trizol提取包含miRNAs的HASMCs總RNA，利用丹麥Exiqon公司的miRNAscDNA合成試劑盒和miRNAsSYRBGreenMasterMix試劑盒分別進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，小RNAU6作為各樣本miR-21表達(dá)水平的內(nèi)參照，每組樣本重復(fù)檢測4次。U6及miR-21PCR引物均購自Exiqon公司。
　　 4.細(xì)胞轉(zhuǎn)染

12、
　　 利用Invitrogen公司的Lipofectamine2000分別轉(zhuǎn)染不同濃度的miR-21inhibitor和mimics，調(diào)節(jié)HASMCsmiR-21的表達(dá)水平，化學(xué)修飾的miR-21inhibitor和mimics均由上海吉瑪公司合成，轉(zhuǎn)染PDCD4表達(dá)質(zhì)粒上調(diào)HASMCsPDCD4蛋白水平。轉(zhuǎn)染細(xì)胞48小時(shí)后，給予細(xì)胞牽張力刺激，觀察相應(yīng)的細(xì)胞功能或目的蛋白水平變化。
　　 5.HASMCs增殖檢測

13、r>　　 牽張力干預(yù)體外培養(yǎng)的HASMCs12小時(shí)，利用美國羅氏公司的BrdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒或細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測牽張力對(duì)HASMCs增殖的影響;轉(zhuǎn)染miR-21inhibitor或mimics48小時(shí)后，再給予牽張力干預(yù)12小時(shí)后，BrdU摻入法和細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測HASMCs增殖水平，明確miR-21在牽張力介導(dǎo)的HASMCs增殖中的作用。
　　 6.Westernblot
　　 牽張力刺激HASMCs結(jié)束后，提取胞漿蛋

14、白，測定蛋白濃度后加蛋白上樣緩沖液煮沸5分鐘。取15～20ug蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，利用Westernblot分別檢測p27，p-Rb，以及PDCD4蛋白表達(dá)。每個(gè)樣本重復(fù)檢測4次，β-actin作為內(nèi)參。
　　 7.細(xì)胞凋亡檢測
　　 利用BIPEC公司的AnnexinV-FITCApoptosisDetectionKit檢測HASMCs凋亡情況。牽張力干預(yù)結(jié)束后，用胰酶消化的方法收集細(xì)胞，每個(gè)樣本用400ul

15、bindingbuffer重懸，經(jīng)過15分鐘的AnnexinV-FITC標(biāo)記，5分鐘PI標(biāo)記后，在1小時(shí)內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞流式分析，每個(gè)樣本在流式分析中計(jì)數(shù)10000個(gè)細(xì)胞。
　　 8.實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定pri-miR-21、pre-miR-21、PDCD4mRNA水平
　　 牽張力刺激HASMCs結(jié)束后，利用Trizol提取細(xì)胞總RNA。使用日本TaKaRa公司的cDNA合成試劑盒將樣本總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后利用T

16、aKaRa公司的SYBRGreen實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR引物由上海吉瑪公司合成。PCR反應(yīng)結(jié)束后得到Ct值，并計(jì)算2-△△Ct，β-actin作為pri-miR-21、pre-miR-21、PDCD4mRNA表達(dá)水平的內(nèi)參。
　　 9.細(xì)胞免疫熒光
　　 16％牽張力刺激體外培養(yǎng)的HASMCs3小時(shí)后，利用免疫熒光方法觀察c-fos、c-jun的表達(dá)變化。牽張力刺激細(xì)胞結(jié)束后，免疫染色固定液固定30分

17、鐘，PBS沖洗后加0.1％TritonX-100室溫下孵育8分鐘，繼之用5％BSA封閉30分鐘，經(jīng)PBS沖洗后4℃條件下分別孵育c-fos，c-jun抗體(CellSignalingTechnology,1∶200)過夜，次日，經(jīng)過熒光二抗孵育1小時(shí)，DAPI染核后，在激光共聚焦顯微鏡下，觀察目的蛋白的表達(dá)水平。
　　 10.凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)
　　 利用EMSA方法檢測16％牽張力對(duì)轉(zhuǎn)錄因子AP-1與NF-κB活

18、性的影響。牽張力干預(yù)平滑肌細(xì)胞結(jié)束后，利用Pierce細(xì)胞核蛋白提取試劑盒收集細(xì)胞核蛋白，并利用BCA方法檢測核蛋白的濃度。使用T4連接酶在AP-1與NF-κB雙鏈核苷酸探針末端標(biāo)記[γ-32P]ATP，取8ug核蛋白與標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄因子探針及試劑盒其它成分共計(jì)20ul預(yù)混后，冰上孵育30分鐘，然后用4％非變性膠進(jìn)行電泳，根據(jù)PierceEMSA試劑盒說明書操作具體步驟。
　　 11.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤

19、表示，使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩組之間的比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，多組之間的比較采單因素方差分析，p＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果
　　 1.機(jī)械牽張力對(duì)體外培養(yǎng)的人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HASMCs)miR-21表達(dá)水平的影響
　　 研究結(jié)果顯示，在無血清條件下，與靜止培養(yǎng)的細(xì)胞相比，16％牽張力自6小時(shí)開始顯著上調(diào)體外培養(yǎng)的HASMCsmiR-21的表達(dá)水平，上調(diào)趨勢保持到24小時(shí)，表達(dá)

20、高峰在12小時(shí)(p＜0.01）;而10％牽張力對(duì)HASMCsmiR-21的表達(dá)水平?jīng)]有顯著影響(p＞0.05）。在有血清刺激的條件下，16％牽張力仍然持續(xù)上調(diào)miR-21的表達(dá)(p＜0.01)，但上調(diào)幅度沒有無血清條件下明顯;而10％牽張力明顯抑制miR-21的表達(dá)，與靜止對(duì)照相比，miR-21的表達(dá)6小時(shí)開始顯著下調(diào)(p＜0.05)，12小時(shí)下調(diào)最明顯。
　　 2.miR-21在機(jī)械牽張力調(diào)控人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖中的作用

21、r>　　 利用BrdU摻入法與細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法檢測miR-21在牽張力調(diào)節(jié)的HASMCs增殖中的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與靜止培養(yǎng)的細(xì)胞相比16％牽張力顯著增強(qiáng)HASMCs的增殖水平;轉(zhuǎn)染miR-21抑制物(inhibitor)抑制miR-21的水平，結(jié)果與miRNA陰性對(duì)照inhibitor相比，miR-21的表達(dá)水平下調(diào)42倍(p＜0.01)，而轉(zhuǎn)染miR-21inhibitor的HASMCs增殖水平顯著下降(p＜0.01)。同樣的實(shí)驗(yàn)

22、條件下，利用胰酶消化的方法收集細(xì)胞后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示與BrdU摻入法一致(p＜0.05)。由于在含血清條件下，10％牽張力抑制miR-21的表達(dá)，轉(zhuǎn)染化學(xué)修飾的miR-21類似物(mimics)上調(diào)miR-21的表達(dá)水平，結(jié)果顯示miR-21mimics升高miR-21的表達(dá)70倍(p＜0.01）;而BrdU摻入法結(jié)果顯示，與靜止培養(yǎng)的HASMCs相比，10％牽張力顯著抑制細(xì)胞的增殖水平(p＜0.01)，而轉(zhuǎn)染miR-21mimi

23、cs顯著降低10％牽張力對(duì)HASMCs增殖的抑制作用(p＜0.05)。
　　 Westernblot結(jié)果顯示16％牽張力抑制細(xì)胞周期抑制因子p27的表達(dá)，促進(jìn)p-Rb的表達(dá)(p＜0.01);而與轉(zhuǎn)染miRNA陰性對(duì)照inhibitor相比，miR-21inhibitor部分逆轉(zhuǎn)16％牽張力對(duì)p27，p-Rb表達(dá)的影響(p＜0.01）。
　　 3.miR-21在機(jī)械牽張力介導(dǎo)的人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡中的作用
　　

24、利用Annexin-FITC與PI雙染細(xì)胞凋亡試劑盒檢測牽張力對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示:與靜止對(duì)照組比較，16％牽張力增加體外培養(yǎng)的HASMCs凋亡水平(9.19±0.66vs1.33±0.12，p＜0.01);轉(zhuǎn)染miR-21inhibitor抑制miR-21的水平，結(jié)果顯示與陰性對(duì)照miRNAinhibitor相比較，miR-21inhibitor顯著增強(qiáng)了16％牽張力對(duì)HASMCs的促凋亡作用(25.5±1.61vs9.38±1

25、.57，p＜0.01);在靜止培養(yǎng)的HASMCs中，轉(zhuǎn)染miR-21inhibitor對(duì)細(xì)胞凋亡沒有顯著的影響。在有血清條件下，對(duì)靜止對(duì)照組相比較，10％牽張力對(duì)HASMCs的凋亡沒有顯著影響(p＞0.05)。
　　 4.PDCD4在16％牽張力介導(dǎo)的人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡中的作用
　　 利用TAKARAcDNA合成與SYBRGreenPCR定量試劑盒檢測16％牽張力對(duì)HASMCsPDCDmRNA水平的影響，結(jié)果顯示:與

26、靜止對(duì)照組相比，16％牽張力增加PDCD的mRNA水平1.98倍(p＜0.05)，而Westernblot結(jié)果顯示，16％牽張力顯著抑制PDCD的蛋白水平0.55倍(p＜0.05）。轉(zhuǎn)染miR-21inhibitor后，16％牽張力對(duì)HASMCsPDCD4蛋白水平的抑制作用明顯減輕(p＜0.05)。為明確PDCD4在牽張力誘導(dǎo)的HASMCs凋亡中的作用，轉(zhuǎn)染PDCD4表達(dá)質(zhì)粒上調(diào)其蛋白表達(dá)水平，再給予16％牽張力刺激，細(xì)胞流式結(jié)果顯示，

27、轉(zhuǎn)染PDCD4表達(dá)質(zhì)粒明顯促進(jìn)16％牽張力的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用(p＜0.01）。
　　 5.16％牽張力對(duì)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞AP-1、NF-κB活性的影響
　　 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測16％牽張力對(duì)HASMCsmiR-21轉(zhuǎn)錄初級(jí)產(chǎn)物pri-miR-21，前體pre-miR-21水平的影響，結(jié)果顯示對(duì)靜止對(duì)照相比，16％牽張力分別增加pri-miR-21水平1.73倍(p＜0.05)，pre-miR-21水平2.

28、85倍(p＜0.01)。AP-1、NF-κB是介導(dǎo)機(jī)械牽張力調(diào)控平滑肌細(xì)胞生物學(xué)功能的重要轉(zhuǎn)錄因子，在特定條件下也參與miR-21的表達(dá)調(diào)控。
　　 Westernblot結(jié)果顯示，16％牽張力明顯增加NF-κBp65的磷酸化水平，高峰在牽張力干預(yù)后1、3小時(shí)，至6小時(shí)恢復(fù)至靜止對(duì)照水平，而16％牽張力對(duì)NF-κBp65的蛋白水平?jīng)]有顯著影響;16％牽張力持續(xù)引起c-jun的表達(dá)水平和磷酸化水平顯著增高，但對(duì)c-fos蛋白的表達(dá)

29、水平及磷酸化水平?jīng)]有明顯影響。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，16％牽張力增加c-jun在細(xì)胞核中的表達(dá)，而增加c-fos在胞漿中的表達(dá)，c-fos在胞核中的表達(dá)沒有顯著變化。EMSA結(jié)果顯示，16％牽張力顯著增加HASMCsAP-1與NF-κB的活性(p＜0.05)。
　　 6.AP-1、NF-κB在16％牽張力誘導(dǎo)HASMCsmiR-21表達(dá)中的作用
　　 利用Lipo2000轉(zhuǎn)染c-junsiRNA下調(diào)HASMCsc-jun

30、的表達(dá)，16％牽張力干預(yù)HASMCs前1小時(shí)，加入NF-κB抑制劑SN50抑制其活性(p＜0.01)。結(jié)果顯示，c-junsiRNA明顯抑制HASMCs中c-jun的表達(dá)，16％牽張力誘導(dǎo)的AP-1活性顯著下降(p＜0.01)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，c-junsiRNA抑制16％牽張力誘導(dǎo)的miR-21表達(dá)(p＜0.01)，而SN50對(duì)16％牽張力誘導(dǎo)的miR-21表達(dá)沒有明顯作用(p＞0.05)。
　　 結(jié)論