我國福氏志賀菌F4c亞型流行病學(xué)特征及變遷規(guī)律的研究.pdf

1、20世紀(jì)70年代末，福氏志賀菌F4c亞型首次被前蘇聯(lián)科學(xué)家分離，并提示其可能成為優(yōu)勢流行菌株。自2003年10月起，我國多個(gè)省市均發(fā)現(xiàn)該菌的爆發(fā)或散發(fā)流行，且在部分省市呈逐年上升的趨勢，已成為部分地區(qū)細(xì)菌性痢疾流行的優(yōu)勢菌型。由于目前各地僅對局部的福氏志賀菌F4c亞型進(jìn)行了分離鑒定，福氏志賀菌F4c亞型的整體情況及特征卻知之甚少。
　　為全面了解其福氏志賀菌F4c亞型的生物學(xué)特性、流行特征和變異規(guī)律，本研究對2003年至2013年

2、期間收集的來源于7個(gè)省市的F4c菌株進(jìn)行了生化特征、血清學(xué)特征、毒力基因及耐藥譜進(jìn)行生物學(xué)特征分析，對其脈沖場凝膠電泳(Pulsed—field gel electrophoresis，PFGE)、多位點(diǎn)序列分型(Multilocus Sequenee Typing，MLST)、質(zhì)粒圖譜進(jìn)行分析，了解其分子分型特點(diǎn)，并對F4c亞型進(jìn)行了全基因組測序，以期通過多種實(shí)驗(yàn)方法深入了解我國福氏志賀菌F4c亞型的生物學(xué)特性、流行特征和變異規(guī)律，對

3、于進(jìn)一步研究細(xì)菌性痢疾的傳播流行規(guī)律及防控策略的制定和調(diào)整均有重要的科學(xué)意義。
　　本研究收集了2003年至2013年期間，包括北京、新疆、上海、甘肅、沈陽、廣西和河南等7個(gè)省及直轄市共30多家哨點(diǎn)醫(yī)院分離的204株福氏志賀菌F4c亞型。通過血清學(xué)鑒定、生化鑒定、藥物敏感實(shí)驗(yàn)和毒力基因檢測，從204株F4c亞型中挑選出流行病學(xué)和遺傳背景無關(guān)的11株代表性菌株進(jìn)行血清O抗原基因的鑒定，以全面了解其生物學(xué)特性。對204株福氏志賀菌F4

4、c亞型進(jìn)行PFGE分子分型;并從中選取不同地區(qū)、不同年份且毒力基因型別差異較大的60株進(jìn)行質(zhì)粒圖譜分析、37株進(jìn)行MLST分子分型，選擇北京地區(qū)分離的1株福氏志賀菌F4c亞型進(jìn)行全基因組測序。
　　日本Denka Seiken血清凝集實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:204株福氏F4c型菌株與福氏多價(jià)血清發(fā)生強(qiáng)凝集反應(yīng)、與福氏Ⅳ型多價(jià)發(fā)生強(qiáng)凝集反應(yīng)、與群因子血清7(8)發(fā)生凝集反應(yīng);但不與群因子血清(3)4、6發(fā)生血清凝集反應(yīng)。血清抗原結(jié)構(gòu)式為(Ⅳ:

5、7，8)，與文獻(xiàn)報(bào)告的F4c血清分型結(jié)果均相同。使用瑞典單克隆抗體血清(MASF)進(jìn)一步細(xì)化血清學(xué)分型鑒定，結(jié)果顯示204株福氏F4c型菌株與血清群福氏多價(jià)B抗體呈凝集反應(yīng)，與群因子血清7，8呈凝集反應(yīng)，與群因子血清Ⅳ-1呈凝集反應(yīng)，與其他各個(gè)型因子血清均不凝集，MASF血清鑒定結(jié)果MASF:B+，Ⅳ:I+，7(8)+;與FXv的MASF血清鑒定結(jié)果相同。另外，挑選11株代表性菌株鑒定其福氏4型和福氏X型部分血清O抗原特異性基因，結(jié)果發(fā)

6、現(xiàn)本研究的福氏志賀菌F4c亞型100％攜帶福氏志賀菌wzx1-5型O抗原合成基因;100％攜帶O抗原修飾基因gtrX（葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因）;100％不攜帶O抗原修飾基因gtrⅣ基因（葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因）和oac基因（O-乙?；D(zhuǎn)移酶基因），F(xiàn)4c所攜帶的部分血清O抗原特異性基因與FXv相同。
　　204株福氏志賀菌F4c亞型的API-20E生化反應(yīng)鑒定結(jié)果:以發(fā)酵葡萄糖、分解甘露醇為主，有四種生化反應(yīng)結(jié)果存在差異，主要包括吲哚實(shí)驗(yàn)

7、，明膠液化實(shí)驗(yàn)，蜜二糖實(shí)驗(yàn)和阿拉伯糖實(shí)驗(yàn)。204株福氏志賀菌F4c亞型中，吲哚實(shí)驗(yàn)陽性菌株共有28株（占13.73％）;明膠液化實(shí)驗(yàn)陽性菌株共有2株（占0.98％）;蜜二糖實(shí)驗(yàn)陽性菌株共有26株（占12.75％）;阿拉伯糖實(shí)驗(yàn)陽性菌株共有201株（占98.53％）。在204株福氏志賀菌F4c亞型中，吲哚實(shí)驗(yàn)陽性菌株比例較高的地區(qū)是河南和沈陽，吲哚實(shí)驗(yàn)陽性菌株最多的年份為2007年。蜜二糖實(shí)驗(yàn)陽性菌株最多的地區(qū)為甘肅、河南和新疆，蜜二糖實(shí)

8、驗(yàn)陽性株最多的年份為2003年、2011年和2006年。明膠液化實(shí)驗(yàn)陽性株均分離自廣西，具體年份不詳。阿拉伯糖陰性共有3株，分別為2004年新疆株、北京株和2007年上海株。其中，2株明膠液化實(shí)驗(yàn)陽性菌株為首次在福氏志賀菌F4c亞型中發(fā)現(xiàn)。
　　2009年之后，國內(nèi)報(bào)道的福氏志賀菌F4c亞型菌株對慶大霉素、妥布霉素和二、三代頭孢類抗生素抗生素的敏感率都呈明顯下降趨勢。本次對青霉素類抗生素氨芐西林敏感率僅為3.92％、哌拉西林的敏感

9、率為75.49％;對β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合物類藥物氨芐西林/舒巴坦的敏感率僅為4.41％、而哌拉西林/他唑巴坦的敏感率卻達(dá)100％;頭孢類抗生素敏感實(shí)驗(yàn)的敏感率從76.96％～99.51％不等;三種氨基糖苷抗生素的敏感率達(dá)到84.8％以上;2種氟喹諾酮類抗生素的藥物敏感率分別為86.27％和88.24％;磺胺類（葉酸代謝途徑抑制劑）抗生素復(fù)方新諾明敏感率為29.41％;對呋喃妥因、氨曲南、亞胺培南敏感率＞96.08％。204株福氏志賀菌

10、F4c亞型只有4株對20種抗生素全部敏感。另外，上海、甘肅、河南的多重耐藥率為100％，耐藥達(dá)到3種以上抗生素的菌株占全部菌株數(shù)量的77.45％。北京和上海兩地出現(xiàn)耐10種以上抗生素的菌株，北京耐10種以上抗生素菌株的比例為3.84％，而上海的比例為17.89％。
　　為了解福氏志賀菌F4c亞型的毒力基因攜帶情況，選取與福氏志賀菌相關(guān)的12對毒力基因進(jìn)行檢測，攜帶全部12對毒力基因的菌株達(dá)158株(77.45％)，ipaH1.4和

11、shiD-Full基因在204株菌中的攜帶率為100％，ial基因的攜帶率最低，為86.27％。上海和廣西地區(qū)菌株的ial基因、ipaH基因的攜帶率低于其他地區(qū)的菌株。204株福氏志賀菌F4c亞型可按毒力基因的攜帶情況分為21個(gè)毒力基因型，其中1型占77.45％，是6個(gè)地區(qū)的優(yōu)勢毒力基因模式（廣西除外，廣西為4型和14）。結(jié)合生化結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)吲哚實(shí)驗(yàn)陽性或蜜二糖發(fā)酵陽性抑或阿拉伯糖發(fā)酵陰性時(shí)，福氏志賀菌F4c亞型的毒力基因攜帶率高，

12、毒性比較強(qiáng)，且具有這種生化反應(yīng)結(jié)果的菌株容易引起疫情暴發(fā)。另外，北京和上海兩個(gè)地區(qū)的菌株毒力基因的攜帶情況分析顯示:缺失ipaH9.8基因的福氏志賀菌F4c亞型頭孢類抗生素敏感率降低。
　　本研究選擇了60株毒力基因和抗生素敏感性差異比較明顯的F4c菌株進(jìn)行質(zhì)粒圖譜分析:該菌攜帶的質(zhì)粒呈現(xiàn)多樣化，60株菌中21株攜帶220kb左右的大質(zhì)粒，23株攜帶140kb左右的大質(zhì)粒;60株菌中60株攜帶4.1kb的小質(zhì)粒，56株菌攜帶2.2

13、 kb的小質(zhì)粒，55株菌攜帶1.8kb的小質(zhì)粒;不帶有10.5kb和4.8kb的小質(zhì)粒;出現(xiàn)了1.0kb的小質(zhì)粒。60株存在4.1kb小質(zhì)粒的菌株均帶有毒力基因shiD-Full和ipaH1.4;7株缺失毒力基因ial、ipaH7.8和ipaH4.5的菌株具有3～5個(gè)不同的小質(zhì)粒;27株ial基因陰性的菌株中，25株不具有大小在220kb的毒力大質(zhì)粒。
　　本研究使用NotI限制性內(nèi)切酶對204株福氏志賀菌F4c亞型進(jìn)行PFGE分

14、子分型分析。酶切片段在20 kb至135kb之間，每株菌可得到大約14條左右的PFGE條帶。204株福氏志賀菌F4c亞型Dice系數(shù)在80％～100％之間，共生成81個(gè)帶型，優(yōu)勢帶型為FN11.004（31株，占15.20％）;可分為28個(gè)聚類型:聚類1型(FN11.001-FN11.023)共108株，占52.94％;聚類2型（FN11.024-FN11.029）共17株，占8.33％;聚類4型(FN11.032-FN11.036)共

15、8株，占3.92％;聚類10型(FN11.046-FN11.050)共7株，占3.43％;聚類18型(FN11.064-FN11.067)共9株，占4.41％;其余各聚類菌株數(shù)量均在5株以下。聚類分析發(fā)現(xiàn)2009生之前的菌株遺傳相似程度比較高，除河南以外（不排除河南菌株較少的原因），各地區(qū)菌株Dice系數(shù)均在80％～92％之間。北京地區(qū)、新疆地區(qū)和沈陽三地的F4c菌株優(yōu)勢帶型均為FN11.004;11株廣西地區(qū)F4c亞型分為11個(gè)帶型和

16、7個(gè)聚類型。
　　多位點(diǎn)序列分析(MLST)分析發(fā)現(xiàn):所有的F4c亞型菌株之間的等位基因值相同，均屬于相同的序列型ST245。從系統(tǒng)進(jìn)化圖分析，ST245與ST651、ST633、ST627、ST255和ST240等屬于ST245 Cplx，只有1個(gè)位點(diǎn)的變異，遺傳距離較近，可以說明它們之間的親緣關(guān)系也較近。ST629、ST631、ST264和ST248、ST630也屬于ST245 Cplx，有2-3個(gè)位點(diǎn)的變異，ST245 Cp

17、lx極有可能由ST270的EIEC進(jìn)化而來。
　　全基因組測序后的結(jié)果分析顯示，福氏志賀菌F4c亞型與參考菌株福氏志賀菌FXv亞型O抗原序列相似度較高，但F4c還有來源于F2a和大腸等及其他菌型的基因和質(zhì)粒，這些差別到底會對福氏志賀菌F4c亞型的致病性和表型產(chǎn)生多大影響尚未得知，但目前分析的結(jié)果至少提示F4c與FXv為同一血清型，可能屬于同一血清型的不同基因型。
　　本次分析的福氏志賀菌F4c亞型O抗原特異性基因gtrX陽性

18、，與Fx及Fxv相同，而血清凝集實(shí)驗(yàn)為福氏4型，與FX及FXv均不相同，可能命名為F4型或F4v型比較合適。本次研究的福氏志賀菌F4c亞型菌株發(fā)酵葡萄糖，甘露醇實(shí)驗(yàn)陽性，并首次檢出來源于廣西的明膠液化陽性菌株。我國福氏志賀菌F4c亞型對氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦普遍耐藥，對哌拉西林、復(fù)方新諾明、慶大霉素、妥布霉素和二、三代頭孢類抗生素的耐藥率也呈逐年上升的趨勢，對喹諾酮類抗生素敏感。北京地區(qū)我國福氏志賀菌F4c亞型耐藥率低，毒力基因攜帶