基于菲律賓蛤仔的近海多環(huán)芳烴生物監(jiān)測技術的研究.pdf

1、多環(huán)芳烴(PAHs)是持久性有機污染物(POPs)的一種，分子中含有兩個或兩個以上苯環(huán)的碳氫化合物，多數(shù)具有“三致”效應，即致癌性、致畸性和致突變性，可通過生物累積及食物鏈傳遞給海洋生物，給生態(tài)環(huán)境和人體健康帶來極大危害，目前已引起各國環(huán)境科學家的極大重視。2011年歐盟委員會發(fā)布Regulation(EC) No835/2011法規(guī)提出以苯并(a)芘(BaP)、苯并(a)蒽(BaA)、苯并(β)熒蒽(BbF)和屈(Chr)4種多環(huán)芳烴

2、總含量作為食品中PAHs限量的新評價標準。本論文選擇我國沿海重要經(jīng)濟貝類菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）為研究對象，利用數(shù)字基因表達譜和基因克隆表達分析研究了菲律賓蛤仔在PAHs脅迫下解毒代謝的分子機制;研究了PAHs對菲律賓蛤仔不同組織累積含量、解毒代謝酶和相關基因以及損傷效應的影響，初步探討了PAHs在菲律賓蛤仔體內(nèi)蓄積規(guī)律和毒性效應，篩選基于菲律賓蛤仔的用于海洋PAHs污染評價的生物標志物;并且通過對膠

3、州灣、萊州灣近海養(yǎng)殖水環(huán)境PAHs的含量分析以及基于菲律賓蛤仔的雙殼貝類PAHs生物監(jiān)測分析，驗證了生物標志物的有效性，也為評價PAHs對海洋生物毒性效應、保障水產(chǎn)品質量安全和監(jiān)測海洋環(huán)境PAHs污染提供理論基礎。
　　1、菲律賓蛤仔在PAHs脅迫下解毒代謝分子機制的研究
　　本章首先利用數(shù)字基因表達譜(DGE)技術分析了BaP（1μg/L）脅迫15天時菲律賓蛤仔消化盲囊組織差異基因表達情況，對照組和染毒組分別獲得了1050

4、8312和11414297條clean reads，將clean reads上傳至NCBI SRA文庫(accession number:SRP034889);將clean reads與本實驗室已完成拼接的菲律賓蛤仔轉錄組文庫unigene進行拼接比對，比對率分別為53.27％和52.22％;通過DGE序列比對分析，共篩得差異表達基因145條，其中上調(diào)基因58條，下調(diào)基因87條;經(jīng)GO功能聚類分析以及KEGG通路分析顯示，差異基因主要涉

5、及機體生長發(fā)育、抗氧化代謝、細胞凋亡以及解毒代謝機制;運用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術，選取5條差異表達關鍵基因（熱激蛋白22、谷胱甘肽過氧化物酶、Mantle gene6、皮連蛋白3、假定蛋白）以及8條非差異表達解毒代謝關鍵基因（芳烴受體、熱激蛋白90、熱激蛋白70、環(huán)氧化物水解酶、二氫二醇脫氫酶、磺基轉移酶、谷胱甘肽S轉移酶、超氧化物歧化酶）驗證了DGE結果可靠性。
　　通過RACE和RT-PCR技術獲得菲律賓蛤仔

6、熱激蛋白70(HSP70)、熱激蛋白90(HSP90)基因的cDNA全長序列，其中HSP70全長2336 bp(GenBank Accession Number:KJ569079)，HSP90全長2839 bp(GenBank Accession Number:KJ569080);序列分析表明HSP70基因含有51 bp的5'端非編碼區(qū)、335 bp的3'端非編碼區(qū)和1950 bp的開放閱讀框，開放閱讀框編碼650個氨基酸;HSP90基

7、因含有107bp的5'端非編碼區(qū)、554 bp的3'端非編碼區(qū)和2178 bp的開放閱讀框，開放閱讀框編碼726個氨基酸;同源性分析顯示2種基因的蛋白序列與其它雙殼貝類的HSP具有較高的同源性;系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)，兩者均與其它雙殼貝類親緣關系最近，與蝦蟹等節(jié)肢動物次之，而與硬骨魚類和高等脊椎動物親緣關系較遠;組織特異性分析發(fā)現(xiàn)HSP70與HSP90在菲律賓蛤仔消化盲囊、鰓、閉殼肌和外套膜中均有表達，兩者均在消化盲囊和鰓中表達量較高;并且

8、通過qRT-PCR技術初步研究了HSP70和HSP90在菲律賓蛤仔PAHs解毒代謝中的功能。
　　2、菲律賓蛤仔在PAHs脅迫下生物標志物篩選技術的研究
　　本章以菲律賓蛤仔為研究對象，將其暴露于PAHs(混合比例BaP∶ BbF∶ Chr∶ BaA=1∶1∶1∶1;染毒梯度:0、0.05、0.5、5μg/L)21d，分別于0、1、3、6、10、15、21d取樣，之后停止染毒，進行PAHs消除實驗，分別于22、24、27、3

9、1、36d取樣，取樣組織為鰓、消化盲囊、閉殼肌。測定了PAHs在4種組織中的累積含量，研究了PAHs在菲律賓蛤仔體內(nèi)的蓄積特征與消除規(guī)律，結果表明，各處理組不同組織中PAHs的累積含量在染毒實驗時間內(nèi)呈逐漸升高趨勢，呈現(xiàn)時間-劑量效應，在同一染毒濃度下，相同組織中4種PAHs累積含量的順序基本為Chr＞BaA＞BaP＞BbF;不同組織中PAHs蓄積含量的順序基本為消化盲囊＞鰓＞軟體部＞閉殼肌。消除實驗開始后，PAHs的累積含量顯著下降，

10、基本在31d趨于穩(wěn)定，實驗結束后中、高濃度PAHs處理組中PAHs累積含量仍然顯著高于對照組。整個實驗過程中，對照組無顯著變化。
　　為了研究PAHs在菲律賓蛤仔體內(nèi)的毒性效應，取染毒和消除實驗中的鰓和消化盲囊組織，測定了以下幾種解毒代謝酶及相關基因(i)Ⅰ相解毒代謝酶(AHH、DD、EH)和Ⅱ相解毒代謝酶(GST、UGT、SULT);(ii)抗氧化防御酶相關指標(總抗氧化能力、SOD、GSH/GSSG);(iii)生物大分子損傷

11、（DNA鏈斷裂、蛋白羰基化、脂質過氧化）解毒代謝關鍵基因表達（PgP、AhR、HSP90、ARNT、EH、DD、GST、SULT、SOD）。結果表明，不同濃度處理組鰓和消化盲囊組織中所有指標均被不同程度誘導，都具有明顯的時間-劑量效應，其中消化盲囊組織比鰓變化明顯。依據(jù)PAHs累積含量與不同指標之間的相關性分析，選取相應的指標作為評價海洋PAHs污染的生物標志物。
　　3、基于菲律賓蛤仔的膠州灣、萊州灣PAHs生物監(jiān)測技術的研究<

12、br>　　膠州灣（紅島、營海）、萊州灣（廣利港、下營港）近海不同季度現(xiàn)場取樣（3月、6月、9月、12月）結果表明，膠州灣營海站點的表層海水與沉積物中PAHs污染較嚴重，而萊州灣廣利港的PAHs污染情況要比下營港嚴重;各站點中6月和9月的PAHs污染情況較嚴重;菲律賓蛤仔消化盲囊中AHH、GST和SOD酶活力、DNA堿解旋、HSP90、DD和GST的mRNA基因表達與PAHs含量具有較好的一致性，為篩選膠州灣、萊州灣PAHs污染監(jiān)測的有效