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文檔簡介
1、目的:本實驗通過建立咬合創(chuàng)傷和牙周炎動物模型,采用免疫組化技術(shù),觀察在不同時間內(nèi)血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)的動態(tài)表達(dá)變化,推測咬合創(chuàng)傷在牙周組織損傷及修復(fù)過程中的作用機(jī)理,分析與咬合創(chuàng)傷相關(guān)的疾病的發(fā)生機(jī)制,為臨床工作中咬合創(chuàng)傷疾病的早期發(fā)現(xiàn)及治療提供更理想的思路。
方法:選用120只雄性Wistar大鼠(由河北醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供),清潔級,口腔衛(wèi)生狀
2、況良好,咬合關(guān)系良好,無口腔疾病,體重250g-280g,鼠齡為3個月。將大鼠隨機(jī)分為四組,分別為N組(正常對照組)、A組(咬合創(chuàng)傷組)、B組(牙周炎組)、C組(咬合創(chuàng)傷+牙周炎組),每組30只,分別于建模后1天、3天、7天、2周、4周、6周從各組中隨機(jī)選5只處死取材。采用濃度為100g/L的水合氯醛(3ml/Kg)腹腔注射麻醉,將大鼠仰臥固定于操作臺上,用1%碘酊棉簽、75%乙醇消毒雙側(cè)口腔黏膜。A組隨機(jī)選取一側(cè)上頜第一磨牙為實驗牙,
3、選用直徑0.6mm的方絲,截取長度約2mm。用金剛砂小球鉆將咬合面打磨粗糙,隔濕后涂布酸蝕劑,酸蝕30-60秒,用水沖去,棉球隔濕,吹干后涂布粘接劑,光固化;復(fù)合樹脂將方絲粘接至咬合面后光固化。B組隨機(jī)選取一側(cè)下頜第一磨牙為實驗牙,選用直徑0.2mm結(jié)扎絲結(jié)扎于第一磨牙牙頸部,并盡量位于齦溝內(nèi)。C組按上述方法隨機(jī)選擇同側(cè)上下頜第一磨牙為實驗牙建模。N組不作任何處理。
在各自規(guī)定的時間內(nèi),實驗動物按0.3ml/100g劑量,
4、給予10%水合氯醛麻醉后,用4%多聚甲醛經(jīng)心灌注,待灌注結(jié)束后,立即截取磨牙區(qū)組織,保留根尖部骨板及牙齦組織,將樹脂材料及結(jié)扎絲去除,在4℃條件下于4%多聚甲醛溶液中固定48h,再置于10%EDTA溶液4℃環(huán)境中脫鈣4周。進(jìn)行石蠟包埋并切片,切片厚5μm。對切片進(jìn)行HE染色及VEGF免疫組織化學(xué)染色,封片后自然干燥。
利用專業(yè)圖像分析系統(tǒng)ImagePro-Plus6.0軟件對VEGF免疫組織化學(xué)染色結(jié)果陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)采
5、集。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件采用Kruskal-WallisH檢驗對數(shù)據(jù)進(jìn)行總體分析,Wilcoxon秩和檢驗對4個實驗組6個不同觀察期的免疫反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行組間兩兩比較,按α=0.05水準(zhǔn),P≤0.05為結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義,反之,結(jié)果差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。
結(jié)果:
1、H-E染色
1.1、對照組大鼠磨牙冠狀切片顯示,牙周膜排列整齊,根尖牙周膜與牙骨質(zhì)連接緊密,牙槽骨與牙周膜界限明顯,少數(shù)牙槽
6、骨表面可見陷窩,并有多核細(xì)胞分布。在牙周組織血管周圍也可見到有細(xì)胞分布。
1.2、實驗組
牙周膜內(nèi)部的成纖維細(xì)胞少量增多,纖維排列紊亂,牙槽骨表面陷窩增大,數(shù)目增多,在骨陷窩內(nèi)多核細(xì)胞數(shù)量增多,血管數(shù)量呈增多趨勢,在2周組達(dá)到高峰。
2、VEGF免疫組織化學(xué)
2.1、對照組
在下頜磨牙的牙冠周圍的血管中未見陽性細(xì)胞,根尖周圍的牙槽骨表面均未見陽性細(xì)胞。在牙周膜的內(nèi)部,
7、只有少數(shù)大血管內(nèi)有少量VEGF陽性的細(xì)胞。
2.2、實驗組
VEGF陽性細(xì)胞分布具有以下幾個特點:(1)在實驗組中,牙周膜周圍的牙槽骨陷窩中出現(xiàn)VEGF陽性多核細(xì)胞且逐漸增多,VEGF陽性表達(dá)的血管數(shù)量逐漸增多,2周達(dá)到高峰,在4周,6周組表達(dá)有所降低。(2)在所有觀察期的切片中,整個磨牙列,包括第1,2,3磨牙牙槽骨都可見骨陷窩中有VEGF陽性多核細(xì)胞分布,并在牙槽骨內(nèi)的血管中有陽性細(xì)胞分布,集中于實驗牙根
8、尖周圍;實驗牙牙冠牙周組織及實驗牙的鄰牙牙周組織中,未見明顯陽性細(xì)胞分布。(3)對于不同實驗組來說,相同觀察期的VEGF免疫組化結(jié)果顯示,骨陷窩中VEGF免疫陽性多核細(xì)胞數(shù)目及牙周膜中血管的陽性細(xì)胞的數(shù)目在各組之間比較:對照組<牙周炎組<咬合創(chuàng)傷組<咬合創(chuàng)傷+牙周炎組。
結(jié)論:
1、VEGF在各個實驗組牙周組織中的表達(dá),咬合創(chuàng)傷+牙周炎組中VEGF在多個核細(xì)胞和牙周組織血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)強(qiáng)于其他兩組,表明其
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