仲景治療肺痿的辯證規(guī)律及相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis IPF)是指原因不明并以普通『自J質(zhì)性肺炎為特征性病理改變的一種慢性炎癥性間質(zhì)性肺疾病。 歷代醫(yī)家對(duì)于肺痿的認(rèn)識(shí)和治療方法對(duì)于肺痿的辨證論治具有重要意義，但是都散見于各代醫(yī)家著作之中，未經(jīng)系統(tǒng)總結(jié)歸納，本課題的理論研究將對(duì)歷代醫(yī)家和張仲景對(duì)肺痿的認(rèn)識(shí)和治療方法予以系統(tǒng)總結(jié)，旨在遵從前賢所淪的基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展，對(duì)某些混淆的問題予以闡述，探微索隱，為

2、能在臨床上更好的應(yīng)用祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)治療肺痿這種疑難重癥提供理論依據(jù)。 本課題的實(shí)驗(yàn)研究追蹤該領(lǐng)域國(guó)際最新動(dòng)態(tài)，與耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院合作，采用中藥復(fù)方加味桔梗湯，即桔梗湯加銀花、連翹、貫眾等藥物治療特發(fā)性肺纖維化模型小鼠，觀察加味桔梗湯對(duì)特發(fā)性肺纖維化模型小鼠的療效及對(duì)小鼠肺中骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4(Bone Morphogeneticprotein 4 BMP-4)的和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(Bone Morphogenetic protei

3、n 7 BMP-7)影響，探索特發(fā)性肺纖維化過程中加味桔梗湯對(duì)IPF小鼠的治療作用及其對(duì)BMP家族的調(diào)節(jié)作用，以及BMP-4、BMP-7在特發(fā)性肺纖維化模型小鼠肺中的含量變化，為在臨床上應(yīng)用經(jīng)方治療特發(fā)性肺纖維化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并進(jìn)一步探索中藥治療特發(fā)性肺纖維化的作用靶點(diǎn)。 1 理論研究 1.1系統(tǒng)總結(jié) 歷代醫(yī)家對(duì)肺痿的認(rèn)識(shí)及治療法則查閱自秦以降內(nèi)科、方劑、醫(yī)案醫(yī)話、雜著等古代中醫(yī)文獻(xiàn)，對(duì)其進(jìn)行全面的分析、歸納和總

4、結(jié)，探討古代著名醫(yī)家辨治肺痿的經(jīng)驗(yàn)，揭示古代中醫(yī)學(xué)在肺痿診治方面的規(guī)律和巨大成就。 1.2歸納總結(jié) 仲景治療肺痿的辨證規(guī)律“肺痿”病名首見于仲景之《金匱要略·肺痿肺癰咳嗽上氣病脈證治第七》，仲景對(duì)于肺痿的認(rèn)識(shí)及辨證方法，大多后人認(rèn)為止于《會(huì)匱要略》之條文，而其實(shí)在《傷寒雜病論》中，仲景對(duì)于喘證、咳嗽、短氣、虛勞的辨證方法，都可以運(yùn)用于肺痿的辨證治療中。研究仲景治療肺痿的辨證規(guī)律，是為了拓寬《傷寒雜病論》中對(duì)肺痿的認(rèn)識(shí)及治

5、療范圍，為靈活的應(yīng)用經(jīng)方治療肺系疑難重癥提供理論依據(jù)。 2 實(shí)驗(yàn)研究 2.1 加味桔梗湯對(duì)IPF模型小鼠的治療作用 生存率實(shí)驗(yàn)取30只C57BL/6小鼠，將小鼠隨機(jī)分為中藥生存曲線組、平陽(yáng)霉素生存曲線組，全部小鼠氣管內(nèi)滴注鹽酸平陽(yáng)霉素造特發(fā)性肺纖維化小鼠模型，造模后，中藥生存曲線組小鼠每R予以加味桔梗湯灌胃，平陽(yáng)霉素生存曲線組小鼠予以生理鹽水灌胃，觀察兩組小鼠的生存狀態(tài)及死亡情況。 結(jié)果表明，中藥生存曲線

6、組小鼠28天生存率為46％，平陽(yáng)霉素生存曲線組小鼠28天生存率為13％，這說明加味桔梗湯對(duì)特發(fā)性肺纖維化模型小鼠有明顯的治療作用，為我們應(yīng)用具有清熱解毒的中藥復(fù)方治療特發(fā)性肺纖維化提供了一個(gè)整體性實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 2.2 IPF模型小鼠肺組織標(biāo)本病理觀察 實(shí)驗(yàn)小鼠造模同支氣管灌洗實(shí)驗(yàn)，在造模后第0天、1天、3天、5天、9天、14天、28天分別在平陽(yáng)霉素組、加味桔梗湯組、生理鹽水組取8只小鼠的部分右肺，將小鼠肺組織標(biāo)本(右肺葉)

7、用10％福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，HE染色，觀察小鼠肺部病理變化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加味桔梗湯對(duì)IPF模型小鼠有顯著的治療作用，加味桔梗湯組小鼠肺部的炎癥明顯較平陽(yáng)霉素組小鼠輕，炎性細(xì)胞減少，在造模后第28天，加味桔梗湯組小鼠沒有出現(xiàn)肺部早期纖維化的趨勢(shì)。 2.3 IPF模型小鼠支氣管灌洗實(shí)驗(yàn) 取200只C57BL/6小鼠，隨機(jī)分為三組，即生理鹽水組、平陽(yáng)霉素組、加味桔梗湯組。生理鹽水組取C57BL/6小鼠60只，平陽(yáng)

8、霉素組、加味桔梗湯組分別取C57BL/6小鼠70只。生理鹽水組小鼠不造模，平陽(yáng)霉素組、加味桔梗湯組小鼠氣管滴注博萊霉素造特發(fā)性肺纖維化小鼠模型，在造模后第0天、1天、3天、5天、9天、14天、28天分別在平陽(yáng)霉素組、加味桔梗湯組、生理鹽水組取8只小鼠，進(jìn)行肺部病理變化肉眼觀察，并進(jìn)行支氣管灌洗，于10倍顯微鏡下進(jìn)行總細(xì)胞記數(shù)，Jamsa染色后進(jìn)行中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞百分比記數(shù)。中性粒細(xì)胞是在早期急性肺損傷/肺胞炎階段的主要炎性

9、細(xì)胞。在造模后前五天，平陽(yáng)霉素組、加味桔梗湯組的中性粒細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比都出現(xiàn)增高，與生理鹽水組比較都有非常顯著性差異，這說明，加味桔梗湯組和平陽(yáng)霉素組在造模后早期都存在肺泡炎和肺部的損傷，從造模后第九天開始，平陽(yáng)霉素組、加味桔梗湯組的中性粒細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比都趨于下降，加味桔梗湯組的中性粒細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比下降幅度較平陽(yáng)霉素組占細(xì)胞總數(shù)的百分比下降幅度大，到第二十八天，平陽(yáng)霉素組與生理鹽水組比較仍有顯著性差異，而加味桔梗湯

10、組與生理鹽水組比較沒有顯著性差異。說明加味桔梗湯促進(jìn)了IPF小鼠肺部炎癥的吸收、感染的痊愈以及肺組織的修復(fù)。 在造模后，平陽(yáng)霉素組、加味桔梗湯組的淋巴細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比都出現(xiàn)升高，平陽(yáng)霉素組淋巴細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比從造模后第三天起呈逐漸增高的趨勢(shì)，到第九天時(shí)達(dá)到高峰，到第十四天后有所下降，但是與生理鹽水組比較仍有顯著性差異。加味桔梗湯組的淋巴細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比也出現(xiàn)增高，但從造模后第五天，加味桔梗湯組的淋巴細(xì)胞占

11、細(xì)胞總數(shù)的百分比又逐漸下降，到造模后第二十八天，與生理鹽水組相比較已經(jīng)沒有顯著性差異。淋巴細(xì)胞則是繼巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞之后出現(xiàn)的炎性細(xì)胞，但淋巴細(xì)胞在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持高水平狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)肺內(nèi)巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的增多先于淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)也支持這一觀點(diǎn)。在本研究中也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)谄咛旆蝺?nèi)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)達(dá)高峰時(shí)，成纖維細(xì)胞也明顯增多，而造模十四天后，隨著成纖維細(xì)胞的增多和膠原沉積的增加，肺內(nèi)炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)也以淋巴細(xì)胞為主，表明淋巴細(xì)胞與成纖維細(xì)胞

12、的增殖和膠原合成的增多有關(guān)。 2.4 ELISA法測(cè)IPF模型小鼠左肺組織BMP蛋白水平實(shí)驗(yàn) 在造模后第0天、1天、3天、5天、9天、14天、28天分別取平陽(yáng)霉素組、加味桔梗湯組、生理鹽水組8只小鼠的左肺，用酶聯(lián)接免疫吸附劑測(cè)定(Enzyme-Linked ImmunosorbnentAssay ELISA)方法測(cè)小鼠左肺組織BMP-4和BMP-7蛋白水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，平陽(yáng)霉素組及加味桔梗湯組小鼠的BMP-7蛋白含量在

13、造模后五天內(nèi)與生理鹽水組小鼠相比較均呈下降趨勢(shì)，但加味桔梗湯組小鼠逐漸抑制住了BMP-7蛋白含量的下降趨勢(shì)，在第九天BMP-7蛋白含量開始回升，在第十四天基本恢復(fù)正常。而平陽(yáng)霉素組的BMP-7蛋白含量一直趨于下降趨勢(shì)，到第二十八天與生理鹽水組比較仍有顯著性差異。但中藥治療沒有抑制住加味桔梗湯組小鼠BMP-4蛋白含量的下降趨勢(shì)，與生理鹽水組比較有顯著性差異。 2.5 RT-PCR法測(cè)IPF小鼠右肺BMPmRNA基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)

14、 在IPF小鼠造模后第0天、1天、3天、5天、9天、14天、28天分別取平陽(yáng)霉素組、加味桔梗湯組、生理鹽水組8只小鼠的右肺，用RT-PCR方法測(cè)小鼠右肺組織BMP-4和BMP-7mRNA基因表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加味桔梗湯組和平陽(yáng)霉素組小鼠肺部BMP-4mRNA的基因表達(dá)都較生理鹽水組降低，從造模后開始呈持續(xù)性下降，說明中藥加味桔梗湯對(duì)特發(fā)性肺纖維化模型小鼠肺部BMP-4mRNA的基因表達(dá)沒有明顯的調(diào)節(jié)作用。 加味桔梗湯組和平

15、陽(yáng)霉素組小鼠肺部的BMP-7mRNA的基因表達(dá)在造模后都較生理鹽水組出現(xiàn)降低，平陽(yáng)霉素組小鼠肺部的BMP-7mRNA的基因表達(dá)從造模后開始呈持續(xù)性下降，加味桔梗湯組小鼠肺部BMP-7mRNA的基因表達(dá)在造模后也出現(xiàn)下降，但是從第五天開始出現(xiàn)緩慢的回升，這說明，中藥加味桔梗湯可以提高特發(fā)性肺纖維化模型小鼠肺部BMP-7mRNA的基因表達(dá)，BMP-7有可能是中藥治療特發(fā)性肺纖維化模型小鼠的作用靶點(diǎn)。 本課題的實(shí)驗(yàn)研究從特發(fā)性肺纖維化

16、模型小鼠的生存狀態(tài)、肺部病理變化動(dòng)態(tài)觀察、肺部BMP-4、BMP-7含量動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)幾個(gè)方面來研究加味桔梗湯對(duì)特發(fā)性肺纖維化模型小鼠的治療作用。通過以上實(shí)驗(yàn)研究，可以得出以下結(jié)論 1 中藥生存曲線組小鼠28天生存率遠(yuǎn)高于平陽(yáng)霉素生存曲線組小鼠，說明加味桔梗湯對(duì)特發(fā)性肺纖維化模型小鼠有顯著的治療作用。 加味桔梗湯組小鼠肺部的炎癥和肺損傷明顯較平陽(yáng)霉素組小鼠輕，淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞滲出減少，在造模后28天，加味桔梗湯組小鼠沒有

17、出現(xiàn)肺部的纖維化。 3 IPF模型小鼠肺中BMP-4、BMP-7蛋白含量和mRNA基因表達(dá)均出現(xiàn)下降，中藥加味桔梗湯對(duì)IPF模型小鼠肺中的BMP-4的蛋白含量和mRNA基因表達(dá)沒有調(diào)節(jié)作用，但加味桔梗湯提高了IPF模型小鼠肺中BMP-7的蛋白含量和mRNA基因表達(dá)。說明中藥加味桔梗湯治療特發(fā)性肺纖維化的作用靶點(diǎn)有可能是BMP-7。 以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果都表明，中藥加味桔梗湯對(duì)IPF模型小鼠有治療作用，其作用機(jī)制是提高IPF模型小