大容量人天然抗體庫(kù)的構(gòu)建、鑒定及初步應(yīng)用.pdf

1、抗體藥物是近年來(lái)發(fā)展最快的生物技術(shù)藥物。抗體藥物主要用于腫瘤、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等難治性疾病的診斷和治療。人源抗體一般不會(huì)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，能有效地激活人體的生物效應(yīng)，半衰期長(zhǎng)，因此，人源抗體研制技術(shù)是開(kāi)發(fā)治療性抗體的關(guān)鍵。 傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體費(fèi)時(shí)費(fèi)力。噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的出現(xiàn)使抗體的制備產(chǎn)生了突破性的進(jìn)展。噬菌體展示技術(shù)是一種基因表達(dá)產(chǎn)物與親和選擇結(jié)合的技術(shù)。它是將外源DNA與噬菌體外殼蛋白基因通過(guò)接頭相連，進(jìn)而使外源DNA

2、產(chǎn)物與外殼蛋白融合，并展示在噬菌體表面。經(jīng)過(guò)幾輪吸附-洗脫-富集后，可獲得大量目的噬菌體富積。雖然噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)應(yīng)用的時(shí)間較短，但在腫瘤的診斷和治療、抗原表位分析、藥物設(shè)計(jì)等多個(gè)領(lǐng)域顯示出了巨大的發(fā)展?jié)撃芎蛷V闊的應(yīng)用前景。 ScFv是由免疫球蛋白的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)通過(guò)一段連接肽連接而成的重組蛋白，是具有高親和力的最小抗體片段。其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，組織穿透力強(qiáng)，，在導(dǎo)向治療方面有著巨大的應(yīng)用潛力。 腫瘤壞死

3、因子α(TNF-α)是一種具有復(fù)雜生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，例如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)等。因此，獲得一種人源中和性抗體以中和過(guò)量的循環(huán)TNF-α具有重要的臨床意義。 本研究旨在構(gòu)建人天然噬菌體單鏈抗體庫(kù)，以TNF-α為靶標(biāo)，從該抗體庫(kù)中篩選到抗TNF-α的單鏈抗體，以期有助于類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病的診治，并說(shuō)明該抗體庫(kù)可用于人源抗體的篩選。 在實(shí)驗(yàn)中我們從未經(jīng)主動(dòng)免疫的健康志愿者的外周血淋巴細(xì)胞中提

4、取總RNA，用RT-PCR擴(kuò)增人抗體重鏈(VH)和輕鏈(VL)可變區(qū)基因，得到了6種的VH家族基因，11種VL家族基因，這些抗體基因家族覆蓋了人抗體基因多樣性的95％以上。采用改進(jìn)的SOEPCR法將VH基因和VL基因連接成人單鏈抗體(scFv)基因，并克隆到噬菌粒載體pCANTAB5E中，將連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1，經(jīng)輔助噬菌體M13KO7超感染，構(gòu)建了庫(kù)容為5.58×109的噬菌體單鏈抗體庫(kù)。采用BstNⅠ2酶切法證明，構(gòu)建的噬菌

5、體單鏈抗體庫(kù)具有良好的多樣性。分離純化TNF-α，并鑒定其活性。以TNF-α為靶標(biāo)對(duì)抗體庫(kù)進(jìn)行7輪的篩選富集，以無(wú)關(guān)蛋白如HPO、人整合素β3胞外區(qū)蛋白為靶標(biāo)作ELISA實(shí)驗(yàn)鑒定結(jié)合特異性，結(jié)果證明篩選到的scFv特異性較好。將其轉(zhuǎn)化非抑制型大腸桿菌TOP10，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE和Westemblot檢測(cè)表明，單鏈抗體在E.coliTOP10中得到了可溶性表達(dá)。然后，我們利用原核表達(dá)了單鏈抗體并進(jìn)行了復(fù)性方面上的研究。