基于“十八反”的中藥配伍禁忌理論基礎(chǔ)研究——中藥海藻與甘草配伍毒效表征與物質(zhì)基礎(chǔ)研究.pdf

1、本論文研究工作為國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）項(xiàng)目:基于“十八反”的中藥配伍禁忌理論基礎(chǔ)研究——“藻戟遂芫俱戰(zhàn)草”配伍關(guān)系與毒效表征的基礎(chǔ)研究中的部分研究內(nèi)容。
　　本論文共分為4章，各章節(jié)的主要內(nèi)容及研究結(jié)果如下:
　　一、文獻(xiàn)研究
　　海藻與甘草配伍禁忌是中藥十八反“藻戟遂芫俱戰(zhàn)草”的組成部分，歷代諸多本草書籍中均有記載。2010版《中華人民共和國藥典》中采納了“十八反”的內(nèi)容，在海藻注意項(xiàng)下標(biāo)明“海藻不宜

2、與甘草同用”。在對相關(guān)文獻(xiàn)整理基礎(chǔ)上，綜述了海藻與甘草配伍禁忌形成的源流以及配伍禁忌的物質(zhì)基礎(chǔ)、生物效應(yīng)、臨床應(yīng)用等現(xiàn)代研究現(xiàn)狀，并在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)本論文的研究思路與方案。
　　二、海藻與甘草配伍毒效表征及其作用機(jī)制研究
　?。ㄒ唬┖Ｔ?甘草反藥組合的毒性評價(jià)
　　1.海藻、甘草各單味藥對小鼠急性毒性評價(jià)
　　對海蒿子水提物進(jìn)行了急性毒性實(shí)驗(yàn)，得出的時(shí)間-死亡率曲線。結(jié)果表明:海蒿子的LD50為30g/kg，95％

3、置信限為26.1-33.9g/kg。并對不同產(chǎn)地、不同基源的海藻進(jìn)行急性毒性研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在海蒿子和羊棲菜30g/kg（為藥典高限劑量的19倍）時(shí)對小鼠灌胃給藥，均對小鼠表現(xiàn)出一定的急性毒性，且毒性反應(yīng)相同。甘草以最大濃度給藥（為甘草藥典高限劑量的48倍）時(shí)，未發(fā)現(xiàn)明顯毒性反應(yīng)和小鼠死亡。
　　2.海藻-甘草反藥組合對大鼠多次給藥毒性評價(jià)
　　為了確定海藻與甘草反藥組合在大鼠體內(nèi)的毒性靶器官和毒性劑量，設(shè)計(jì)了多次灌服（8

4、周）給予大鼠不同劑量海藻與甘草配伍藥組水提物。結(jié)果顯示:海藻-甘草合用導(dǎo)致大鼠血中乳酸脫氫酶和羥丁酸脫氫酶含量升高，病理組織檢查顯示心肌炎性病變;海藻-甘草合用導(dǎo)致大鼠血中谷草轉(zhuǎn)氨酶升高，肝臟點(diǎn)狀壞死;海藻-甘草合用升高大鼠血中肌酐含量，病理組織檢查顯示腎臟間質(zhì)性炎;氯離子與正常組相比顯著降低;綜上，海藻-甘草反藥組合會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)電解質(zhì)平衡失調(diào)，海藻-甘草反藥組合在大鼠體內(nèi)的毒性靶器官為心臟、肝臟和腎臟。
　　（二）海藻對甲狀腺腫大

5、模型大鼠的影響
　　為了考察海藻單煎液對實(shí)驗(yàn)性大鼠甲狀腺腫大的影響，探討海藻治療甲狀腺腫大的劑量和可能機(jī)理，設(shè)計(jì)海藻對甲狀腺腫大模型大鼠的效應(yīng)評價(jià)。甲狀腺指數(shù)結(jié)果表明:模型組和給藥組與正常組相比甲狀腺指數(shù)顯著升高。陽性組、海藻低劑量和海藻高劑量組的大鼠甲狀腺指數(shù)低于模型組，但無顯著性差異。表明海藻和陽性對照藥左甲狀腺素鈉具有一定的消腫功效。大鼠血清中甲狀腺激素的檢測結(jié)果表明:模型組和各藥組的T3、 T4和TSH與正常組相比，無顯著

6、性差異。
　?。ㄈ┖Ｔ迮c甘草反藥組合對大鼠體內(nèi)電解質(zhì)的影響
　　海藻中富含鈉鉀鈣鎂等元素，且含量顯著高于陸生植物，甘草中也富含很多的無機(jī)元素，而且甘草中的甘草皂苷具有鹽皮質(zhì)激素樣作用。兩藥合用，是否會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)電解質(zhì)失調(diào)，進(jìn)而產(chǎn)生一系列的副作用？對此，本研究設(shè)計(jì)了海藻與甘草反藥組合對大鼠水鹽代謝的影響的實(shí)驗(yàn)。單次和多次給藥后尿量測定結(jié)果表明海藻的傳統(tǒng)功效利水消腫并不是通過利尿途徑實(shí)現(xiàn)的;單次和多次給藥后對尿中電解質(zhì)測定結(jié)果表

7、明海藻和海藻-甘草組使得鈉離子、氯離子和鎂離子含量顯著升高;多次給藥后對大鼠血清電解質(zhì)的測定結(jié)果表明海藻-甘草合用后會(huì)導(dǎo)致鎂離子和鈉離子含量高于單用海藻組，且與對照組有顯著差異。提示兩藥合用會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)電解質(zhì)代謝平衡失調(diào)，這可能是海藻與甘草相反的可能機(jī)制之一。
　　三、海藻-甘草配伍毒效物質(zhì)基礎(chǔ)研究
　?。ㄒ唬┖Ｔ寤瘜W(xué)成分分離與結(jié)構(gòu)鑒定
　　迄今對海蒿子的化學(xué)成分研究主要集中在褐藻糖膠的分級純化和結(jié)構(gòu)分析上，而對其中小分

8、子化學(xué)成分的研究較少。為進(jìn)一步研究該中藥的活性成分，本實(shí)驗(yàn)從海蒿子的醇提物中分離得到7個(gè)化合物，分別鑒定為棕櫚酸-α-單甘油酯(1)、十八烷(2)、棕櫚酸(3)、馬尾藻甾醇(4)、甘草苷(5)、甘露醇(6)和尿嘧啶(7)。其中化合物1、5和7是首次從海蒿子中分離得到的化合物。
　?。ǘ┎煌a(chǎn)地海藻化學(xué)成分的分析與評價(jià)
　　1.不同產(chǎn)地海藻無機(jī)元素的分析與評價(jià)
　　基于微波消解-ICP-AES法、碘離子選擇性電極法分別

9、評價(jià)了不同產(chǎn)地海藻藥材中包含有益元素和有害元素共計(jì)30種無機(jī)元素的含量及分布特征。結(jié)果表明不同產(chǎn)地海藻含有19～26種無機(jī)元素，無機(jī)元素平均含量按由高到低的順序依次為K＞Ca＞Na＞Mg。25批海藻樣品有害元素Cu平均值為7.83 mg/kg，Hg為1.54 mg/kg，Pb為3.07 mg/kg，Cd為3.02 mg/kg，As為109.35 mg/kg，Al為1434.26 mg/kg。海蒿子與羊棲菜大部分元素?zé)o顯著性差異。

10、　　2.不同產(chǎn)地海藻砷化學(xué)形態(tài)分析
　　采用電感耦合等離子體-原子發(fā)射光譜(ICP-AES)對不同產(chǎn)地的18批中藥海藻樣品中的總砷進(jìn)行測定，并采用HPLC-HG-AFS分析中藥海藻中水可溶性砷的不同存在形態(tài)和含量。結(jié)果表明中藥海藻中水可溶性砷形態(tài)有As(Ⅲ)、DMA、As(Ⅴ)?？偵楹繛?0.12-170.7mg/kg（干重），在大多數(shù)中藥海藻樣品的水可溶性砷形態(tài)中無機(jī)砷為主要砷形態(tài)，含量為9.836-97.73mg/kg，占總

11、砷比例為24.99％-89.54％。中藥海藻中總砷顯著高于《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》中砷≤2.0 mg/kg的限量標(biāo)準(zhǔn)。無機(jī)砷顯著高于GB19643-2005《藻類制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定藻類制品中無機(jī)砷限量（干重計(jì)）≤1.5mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)。
　　3.不同產(chǎn)地海藻核苷和氨基酸類成分的分析與評價(jià)
　　采用UPLC-TQ-MS對常見褐藻中的核苷和氨基酸類成分進(jìn)行分析，并進(jìn)一步采用主成分分析方法對樣品進(jìn)行評價(jià)。結(jié)果顯示測定

12、的褐藻中富含核苷和堿基類成分，含量范圍為48.46μg/g到4105.00μg/g。22種氨基酸的總量范圍為0.14 mg/g-22.76 mg/g。PCA結(jié)果表明基于核苷、堿基和游離氨基酸的含量，海蒿子和羊棲菜具有相似的化學(xué)特征。
　?。ㄈ┖Ｔ?甘草合用前后的體外化學(xué)成分變化研究
　　1.UPLC/Q-TOFMS分析海藻-甘草配伍化學(xué)成分的變化
　　采用UPLC/Q-TOFMS技術(shù)，結(jié)合MassLynx4.1統(tǒng)計(jì)軟

13、件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，探討海藻與甘草配伍煎煮對其化學(xué)成分的影響。海藻甘草合煎液較合并液，皂苷類成分甘草皂苷A3、22-Acetoxyl-glycyrrhizin和甘草皂苷G2的含量顯著增加，而黃酮類成分甘草素-4'-芹糖苷、甘草苷和異甘草素葡萄糖芹菜苷的含量顯著降低。
　　2.海藻-甘草不同比例配伍的化學(xué)成分變化
　　采用UPLC-TOFMS，考察甘草海藻配伍對組分溶出規(guī)律的影響。結(jié)果表明，在甘草與海藻不同比例配伍時(shí)，來自甘草中的

14、主要成分溶出增加，其中甘草素-4'-芹糖苷、甘草苷和甘草酸的量顯著增加。
　　3.海藻-甘草不同比例配伍對總砷及砷形態(tài)含量的影響
　　以不同比例配伍的海藻-甘草為研究對象，采用電感耦合等離子體-原子發(fā)射光譜(ICP-OES)和高效液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光光譜在線聯(lián)用技術(shù)(HPLC-HG-AFS)，探討海藻-甘草不同比例水煎過程中化學(xué)成分的變化。測定結(jié)果表明:海藻-甘草不同比例配伍會(huì)導(dǎo)致總砷、As(Ⅲ)、DMA含量升高，

15、對As(Ⅴ)的溶出影響不顯著，表明海藻-甘草混合煎煮由于相互作用會(huì)促進(jìn)砷的溶出增加，導(dǎo)致兩藥合煎后毒性增強(qiáng)。甘草能促使海藻中毒性砷的溶出提高，導(dǎo)致毒性增強(qiáng)。海藻中毒性成分溶出增加是海藻與甘草配伍禁忌的可能機(jī)制之一。
　?。ㄋ模┖Ｔ宥拘猿煞值捏w內(nèi)過程研究
　　應(yīng)用HPLC-HG-AFS對海蒿子水提液灌胃給予大鼠的藥代動(dòng)力學(xué)過程進(jìn)行研究。結(jié)果表明，As(Ⅴ)在大鼠體內(nèi)分布和消除很快，DMA相對消除較慢。曲線下面積和最高血藥濃度顯

16、示劑量依賴性關(guān)系。
　　四、基于甲狀腺腫大模型的海藻-甘草配伍量-毒-效關(guān)系研究
　　選用大鼠甲狀腺腫大模型對海藻-甘草的量-毒-效進(jìn)行研究。分別以海藻（海蒿子、羊棲菜）藥典低限劑量、高限劑量、高限2倍;甘草藥典低限劑量、高限劑量、高限2倍設(shè)定26個(gè)配比組，實(shí)驗(yàn)通過觀察甲狀腺腫大模型大鼠的甲狀腺激素和甲狀腺組織切片等指標(biāo)來評價(jià)海藻治療甲狀腺腫大的藥效學(xué)，通過血液生化指標(biāo)及病理組織學(xué)對海藻和甘草配伍的毒理學(xué)進(jìn)行評價(jià)，綜合分析海

17、藻-甘草對甲狀腺腫大模型大鼠的量-毒-效關(guān)系。
　　量-效評價(jià)結(jié)果表明海蒿子、羊棲菜單味藥和海蒿子-甘草和羊棲菜-甘草均能升高大鼠體內(nèi)的甲狀腺激素T3、T4、FT3、FT4水平，對丙硫氧嘧啶導(dǎo)致的甲狀腺激素水平失調(diào)具有恢復(fù)作用。藥典低限劑量海蒿子與藥典低限甘草合用不影響藥效;與藥典高限和藥典高限2倍劑量甘草合用影響藥效，表現(xiàn)為FT4顯著高于正常組。藥典低限劑量羊棲菜與藥典低限和高限劑量甘草合用不影響藥效;與藥典高限2倍劑量甘草合用

18、影響藥效，表現(xiàn)為T4降低，與模型組無差異;藥典高限劑量羊棲菜與藥典低限和高限劑量甘草合用不影響藥效;與藥典高限2倍劑量甘草合用影響藥效，表現(xiàn)為FT4顯著高于正常組。
　　量-毒評價(jià)結(jié)果表明對于甲狀腺腫大模型大鼠，海蒿子在藥典高限劑量Cr與正常組和模型組相比有顯著差異，提示腎臟毒性。羊棲菜在藥典低限劑量TP與正常組和模型組相比有顯著差異，提示肝臟毒性;羊棲菜在藥典高限2倍劑量BUN與正常組和模型組相比有顯著差異，提示腎臟毒性。海蒿子