黑曲霉產(chǎn)酶特性研究及其酶制劑在豬飼料中的應(yīng)用.pdf

1、黑曲霉(Aspergillus niger，An)具備產(chǎn)生多種胞外水解酶的能力。以An FJ-008作為出發(fā)菌株，經(jīng)誘變獲得了菌株An SL2-111，通過對發(fā)酵工藝的優(yōu)化，確定了AnSL2-111最適培養(yǎng)基組成和適宜的工藝條件，并應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。探討該菌酸性蛋白酶粗酶液的提取技術(shù)和純酶的分離純化技術(shù)，并對其酶學(xué)特性、氨基酸組成、動力學(xué)性質(zhì)和活性必需基團(tuán)進(jìn)行了研究。采用RT-PCR和PCR技術(shù)對An SL2-111的酸性蛋白酶基因進(jìn)行

2、了克隆和測序。采用An SL2-111生產(chǎn)飼料復(fù)合酶制劑，飼喂35日齡長白×大約克二元豬，能提高豬對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收率和生長性能。 1、An SL2-111的選育出發(fā)菌株An FJ-008通過紫外線、紫外線和亞硝基胍復(fù)合誘變后，獲得1260個(gè)單菌落，從鑒定平板上挑選到139株變異輻度較大的菌株。將139株變異株按水解圈的大小排列，從不同區(qū)域均勻取樣，共選取16個(gè)菌株。經(jīng)三角瓶固體發(fā)酵培養(yǎng)后，用SPSS10.0對16株菌株所產(chǎn)的

3、酸性蛋白酶發(fā)酵酶活、纖維素酶發(fā)酵酶活和果膠酶發(fā)酵酶活進(jìn)行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)酸性蛋白酶發(fā)酵酶活與纖維素酶、果膠酶發(fā)酵酶活的變化呈正相關(guān)，因此選擇以酸性蛋白酶發(fā)酵酶活的高低作為菌種篩選的依據(jù)。采用此依據(jù)經(jīng)3次復(fù)篩后，獲得1株酸性蛋白酶高產(chǎn)菌株An SL2-111。 An SL2-111與An FJ-008在形態(tài)上有所區(qū)別。前者在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基上培養(yǎng)72 h，每克鮮曲酸性蛋白酶發(fā)酵酶活達(dá)4525 U、果膠酶發(fā)酵酶活達(dá)7015 U、纖維素酶

4、發(fā)酵酶活達(dá)4497 U，分別比出發(fā)菌株An FJ-008提高了97.9％、70.1％和13.4％，而且該菌株經(jīng)斜面?zhèn)鞔囵B(yǎng)5代，產(chǎn)酶特性穩(wěn)定。 2、An SL2-111發(fā)酵工藝的優(yōu)化以酸性蛋白酶發(fā)酵酶活為響應(yīng)值，采用單因素搜索和正交試驗(yàn)對An SL2-111固體發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明An SL2-111適宜在高碳低氮的培養(yǎng)基中生長，添加無機(jī)氮源對菌株產(chǎn)酶影響不大。發(fā)酵培養(yǎng)基本上可分為兩個(gè)階段：第一個(gè)階段為生長培養(yǎng)期(O～24

5、 h)，這個(gè)階段菌絲大量形成，基本上不產(chǎn)酶；第二為產(chǎn)孢和產(chǎn)酶階段(24～60 h)。采用配方培養(yǎng)基和工藝，在250 mL三角瓶中進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，酸性蛋白酶發(fā)酵酶活達(dá)6428 U/g，果膠酶和纖維素酶發(fā)酵酶活分別為8245 U/g和4911 U/g。 3、酸性蛋白酶粗酶液的提取及其穩(wěn)定劑的研究比較了不同溶劑從固體發(fā)酵物中提取酸性蛋白酶粗酶的效果，結(jié)果表明用0.1mol/L乳酸-乳酸鈉緩沖液(pH 3.5)浸提的效果最好，與2％氯化鈉

6、相比回收率提高約50％。在此基礎(chǔ)上確立了最適的浸提工藝，即采用10倍的0.1 mol/L的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH 5.0)于40℃下浸泡60 min后，酸性蛋白酶粗酶的提取較為完全。在對粗酶液的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究后表明，其適宜pH范圍為2.0～4.0。最適作用pH為3.0，pH穩(wěn)定性范圍為3.0～6.0；適宜的溫度作用范圍為50～60℃，最適作用溫度為55℃，粗酶液在30℃和40℃下都較為穩(wěn)定。粗酶液穩(wěn)定性的試驗(yàn)結(jié)果表明，5％的丁

7、醇、5％的山梨酸鉀、氯化鈉、明膠、黃原膠和淀粉均有利于粗酶液酶活的保存。粗酶液穩(wěn)定性長效試驗(yàn)表明1％的黃原膠能使粗酶液的酶活在25℃下保持約45 d。 4、An SL2-111酸性蛋白酶的分離純化及其酶學(xué)特性采用硫酸銨鹽析、DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析、Sephacryl S-200分子篩層析和高效液相色譜等方法，從An sL2-111的發(fā)酵液中提取了一種酸性蛋白酶，經(jīng)SDS-PAGE驗(yàn)證該酶純化

8、水平已達(dá)到電泳純。純化酶的表觀分子量約為47×10<'3>，最適pH值為3.0，最適彬范圍為2.6～3.6，pH穩(wěn)定性范圍為4.0～5.0，最適溫度為60℃，最適溫度范圍為50～65℃，該酶有較好的熱穩(wěn)定性，在40℃或50℃下處理60 min，仍保持85％以上的活力。Cu<'2+>、Mn<'2+>對純化酶有激活作用，Hg<'2+>、Ag<'+>則對純化酶有輕度的抑制作用。純化酶的氨基酸組成中，極性酸性氨基酸占17.29％，極性堿性氨基酸

9、占4.50％，極性中性氨基酸占38.50％，其它為非極性氨基酸；N端氨基酸序列為SKGSAVTTPQ，經(jīng)序列同源性比對，表明該酶與其它曲霉菌株酸性蛋白酶具有極高的同源性。 酸性蛋白酶對酪蛋白的水解性能最強(qiáng)，對牛血紅蛋白及牛血清白蛋白次之，而對雞卵清蛋白的水解性能最弱。動力學(xué)研究結(jié)果表明，酪蛋白的米氏常數(shù)最小(Km=0.22g/L)，最大反應(yīng)速度Vmax為555.56μg Tyr/min mL，親和常數(shù)最大(Vmax/Km=252

10、5.27)，因此酪蛋白是該酶的最適底物。 5、An SL2-111酸性蛋白酶活性必需基團(tuán)的研究采用N-溴代琥珀酰亞胺(NBS)、對氯汞苯甲酸(PCMB)、N-乙酰咪唑(N-AI)、二硫蘇糖醇(DTT)、乙酰丙酮(Acetyl acetOll8)、順丁烯二酸酐(MA)、溴代乙酸(BrAc)和碘化-環(huán)已基-3-(3-三甲氨基丙基)碳二亞胺(CDC)等8種化學(xué)修飾劑對酸性蛋白酶的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行修飾，然后檢測殘留酶活，結(jié)果表明，色氨

11、酸殘基、組氨酸殘基、酪氨酸殘基以及二硫鍵是酶活性必需基團(tuán)，而氨基、巰基、羧基和精氨酸殘基與酶活性無關(guān)。 6、An SL2-111酸性蛋白酶基因的克隆與序列分析采用RT-PCR和PCR技術(shù)從An SL2-111的菌絲體中克隆了酸性蛋白酶的基因序列，該序列包含有1339 bp，包含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，與An和Aspergillus saitoi的曲霉胃蛋白酶I染色體組DNA的核苷酸序列的同源性達(dá)到97％，該基因所編碼的蛋白質(zhì)含

12、有前體，N端70～79位氨基酸序列為SKGSAVTTPQ。 7 An SL2-111產(chǎn)飼料復(fù)合酶制劑對豬的飼養(yǎng)效果利用An SL2-111發(fā)酵生產(chǎn)的飼料復(fù)合酶制劑中含有酸性蛋白酶6290 U/g、纖維素酶4909 U/g、果膠酶5196 U/g和淀粉酶52385 U/g，將其按0％、0.5％、1.0％和1.5％的不同添加量，飼喂35目齡長白×大約克二元雜交仔豬128頭，試驗(yàn)期為63 d，每21 d測定一次增重和耗料、營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率和

13、血液生化指標(biāo)。結(jié)果表明，飼料復(fù)合酶制劑能夠明顯提高仔豬的生產(chǎn)性能和營養(yǎng)物質(zhì)的消化率，粗纖維、粗蛋白、粗灰分、鈣和磷表觀消化率的差異均達(dá)到顯著水平(P<0.05)，血清中的總蛋白、白蛋白、球蛋白、葡萄糖和尿素氮的水平均有不同程度地增加，酶制劑對豬只的心臟、肝臟和腎臟的結(jié)構(gòu)與功能沒有影響。所有加酶的處理組中，以0.1％的加酶組效果最好，它能使3個(gè)生長階段的仔豬增重分別比對照組提高13.57％、30.47％和34.10％，料肉比分別降低21.