中國南方人群α-地中海貧血東南亞缺失型(-SEA)等位基因受到近代自然選擇作用的證據(jù).pdf

1、背景與目的:
　　 α-地中海貧血是世界上最常見的單基因遺傳病之一。其分子基礎是人α-珠蛋白基因發(fā)生突變導致對應的珠蛋白鏈合成不足，使得血紅蛋白的α鏈和非α鏈比例失衡。目前已知的α-地中海貧血突變以大片段缺失為主，僅有少部分是由于點突變導致的。根據(jù)一條染色體上α基因的缺失數(shù)目，可分為α0-地中海貧血(——)和α+-地中海貧血(-α)兩種。α0突變雜合攜帶者（——/αα）表現(xiàn)出一定程度的貧血癥狀，而純合（——/——）則導致嚴重的致

2、死性疾病，胎兒無法存活。其中，東南亞缺失型（——SEA）是最常見的一種α0突變，其缺失片段內包含了Ψα2，Ψα1，α2，α1和θ基因，全長約為20.5kb。——SEA主要分布在東南亞地區(qū)的泰國，菲律賓，越南和中國南部部分地區(qū)。前期的流行病調查顯示，我國南方的廣西和廣東地區(qū)——SEA突變的攜帶率分別為7.84％和4.14％。
　　 ——SEA突變的區(qū)域分布性和其在地區(qū)內的高攜帶率這一現(xiàn)象的產(chǎn)生，一直以來都被認為與其它常見的血紅蛋白

3、變異一樣，是受到瘧疾的自然選擇作用。例如，鐮刀形貧血癥(HbS)、血紅蛋白E(HbE)、血紅蛋白C(HbC)和β地貧CD41/42突變均從流行病調查數(shù)據(jù)和/或單倍型分析等方面提供了有說服力的證據(jù)。意外的是，對包括——SEA在內的α0-地貧突變與瘧疾和自然選擇作用之間的關系卻一直缺少證據(jù)支撐，未見有相關的群體遺傳學和分子進化領域方面的報道。隨著HapMap，SGVP等群體變異數(shù)據(jù)計劃的完善，以及各種快速低廉的DNA變異分型技術的出現(xiàn)，以基

4、因組上的多態(tài)位點信息在群體遺傳學水平上探討自然選擇壓力在攜帶特定變異的染色體上留下的印記成為一種方便且可靠的方法。
　　 本研究擬通過對中國南方人群的——SEA缺失突變相關樣本的群體遺傳學研究，采用基于單倍型分析的方法，檢測自然選擇壓力作用于——SEA缺失在基因組上留下的痕跡，為——SEA是否受到瘧疾的自然選擇提供證據(jù)，以填補該遺傳疾病在分子進化研究領域的空白，為其它類似疾病的研究提供一定的參考。
　　 材料與方法:

5、r>　　 研究樣本為來自中國南方廣東廣西兩個地區(qū)的214個個體。其中——SEA攜帶者76人，正常個體138人。由于樣本并非按照自然攜帶率采集，我們通過隨機數(shù)表，從攜帶者中選取23人與正常個體一起組成一個攜帶率為7％的人工隨機樣本（Constructed Random Samples，CRS），并且后續(xù)的部分分析在兩個樣本集合中都進行。
　　 研究范圍是通過引入HapMap計劃中的北京漢族人群(Han Chinese in Be

6、ijing，CHB)作為參考確定的。掃描16號染色體的起點至——SEA缺失段下游約300kb范圍內的常見單核苷酸多態(tài)性位點(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)，我們篩選出25個標簽SNP，另外再加上本實驗室前期研究所得到的3個SNP，共28個SNP納入研究。這28個SNP覆蓋的基因組范圍約410kb。通過提取樣本的外周血DNA，對這些SNP進行分型。步驟如下:先在10-20個的小樣本集合中采用測序確定

7、基因型，以此為標準品對大樣本使用高分辨率熔解曲線（High-Resolution Melt，HRM）技術進行分型。
　　 分型結果通過Hwsim軟件進行哈迪-溫伯格平衡檢驗（Hardy-Weinberg Equilibrium Test， HWE），該檢驗使用自由度為1的卡方檢驗和蒙特卡洛置換檢驗，檢驗水準α為0.05。之后使用Phase2.1軟件對這28個SNP和——SEA變異位點進行單倍型推斷。在推斷得到的單倍型基礎上做如下

8、分析:首先運用Haploview4.2軟件進行連鎖不平衡(Linkage Disequilibrium， LD)分析，計算并繪制連鎖不平衡圖譜，查看缺失突變與周圍多態(tài)位點的連鎖模式;運用Sweep軟件對樣本進行長單倍型分析（Long-Range Haplotype Test，LRH test），檢驗攜帶——SEA的染色體是否存在正性選擇作用的痕跡，并對——SEA突變出現(xiàn)的時間做粗略的年代估算;運用R軟件分別通過bootstrap過程推斷

9、突變染色體和正常染色體在研究區(qū)段內各個部分的最小重組事件(Minimum Number of Recombination Events，RM)參數(shù)，用以判斷連鎖程度的增加是否來源于大片段缺失引起的缺失段內重組事件消失的影響;最后運用Network4.6.1.0軟件對樣本單倍型進行了中介網(wǎng)絡圖構建，用以分析單倍型之間的親緣關系。
　　 通過上述各個分析結果的綜合總結和討論，可以對——SEA缺失是否受到瘧疾的自然選擇作用做出一個較有

10、說服力的推測。
　　 結果與討論:
　　 28個SNP位點中，除了一個位點rs216091外(x2=4.66，P=0.031)，其余的SNP在CRS群體中均符合Hardy-Weinberg平衡。通過對部分樣本二次測序排除了分型錯誤的可能。通過對攜帶者組和正常人組的等位基因頻率比較，發(fā)現(xiàn)兩個在正常人中次要等位基因(Minor Allele Frequency，MAF)很低的多態(tài)位點（rs3760053和rs77308790

11、）在攜帶者組中頻率很高，提示可能存在有由于自然選擇作用而引起的搭車效應(hitchhiking)。
　　 對CRS樣本進行的連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)，雖然在缺失段下游約70kb處存在有重組熱點區(qū)，導致研究區(qū)段內重組熱點區(qū)上下游的SNP位點之間、重組熱點區(qū)內部SNP之間的連鎖程度很低。但是——SEA缺失與重組熱點區(qū)之后的SNP仍保持較高程度的連鎖，例如，丨D'丨與LOD值顯示，——SEA缺失與下游相距約250kb的rs1698232強連

12、鎖且具有統(tǒng)計學意義(丨D'丨=0.76，LOD=2.13)?？紤]到亞洲人群基因組內的強連鎖很少出現(xiàn)在相距80kb以上的兩個SNP之間，這一距離遠小于——SEA缺失等位基因與重組熱點區(qū)之后連鎖的SNP的距離。另外，前面提到的兩個SNP與——SEA缺失的連鎖模式相似，進一步證明可能存在有搭車效應。
　　 值得注意的是，在本研究中連鎖不平衡程度的增加的可能原因除了自然選擇作用外，也有可能是由于大片段缺失區(qū)域內存在有重組較為活躍的區(qū)域而

13、使缺失染色體的重組比正常染色體少。為了驗證這一可能性，我們比較攜帶——SEA缺失染色體和正常染色體的最小重組事件，分別考慮缺失段上下游區(qū)域的最小重組事件，采用bootstrap方法，得到兩組染色體RM差值的頻數(shù)分布，通過95％分位數(shù)指標比較，我們認為正常染色體的值均遠大于突變染色體（上游:7＞5;下游:9＞2，7，9是實際的RM差值，5和2是boostrap方法所得差值的95％分位數(shù)）。另外，考察HapMap人群數(shù)據(jù)，在缺失段內的區(qū)域也

14、并未發(fā)現(xiàn)有重組熱點區(qū)。兩者都在一定程度上說明了突變染色體的連鎖程度高不是或不完全是大片段的缺失導致突變染色體缺失段內的重組減少引起的。
　　 LRH檢驗在所有樣本群體和CRS樣本群體中均表明，攜帶——SEA缺失的染色體存在有陽性選擇的標志，通過引入SGVP計劃的中國人群CHS(Han Chinese in Singapore)做參照對16號染色體做LRH檢驗，可得到具有相似次要等位基因頻率(MAF)在0.35cM出的REHH頻數(shù)

15、分布，通過95％分位數(shù)指標比較分別得P＜0.004（全樣本）和P＜0.032(CRS)，證明本研究樣本所得的高REHH值具有統(tǒng)計學意義。同時，通過LRH的結果對突變進行粗略年代估算得到——SEA大約起源于3200年前，與瘧疾的流行時間大致吻合，也于其它已證明的具有抗瘧作用的變異出現(xiàn)時間相當（約5000-10000年或更少）。
　　 以——SEA突變等位基因及其下游的7個SNP構建的中介網(wǎng)絡圖顯示，該突變在中國南方人群中來源于單一