異氟醚暴露后大鼠皮層microRNAs表達(dá)變化.pdf

1、目的：
　　1、本研究通過(guò)大鼠異氟醚麻醉模型，利用高通量microRNA芯片技術(shù)檢測(cè)不同濃度異氟醚暴露后大鼠皮層中microRNAs表達(dá)譜變化，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。
　　2、通過(guò)熒光素酶報(bào)告法在細(xì)胞水平對(duì)具有顯著性差異表達(dá)的microRNAs所預(yù)測(cè)的靶基因進(jìn)行驗(yàn)證。
　　方法：
　　1、大鼠異氟醚麻醉模型的建立及檢測(cè)不同濃度異氟醚暴露后大鼠皮層中microRNAs表達(dá)譜變化：雄性SD大鼠12只，體重250±

2、10g，隨機(jī)分為對(duì)照組（Sham）、2.0％異氟醚吸入組（P1組）、1.5%異氟醚吸入組（P2組）、0.75%異氟醚吸入組（P3組），各實(shí)驗(yàn)組均麻醉維持4h。麻醉結(jié)束后24h取大鼠大腦皮層組織，提取總RNA，通過(guò)高通量microRNA芯片技術(shù)檢測(cè)各組microRNA表達(dá)譜，篩選出顯著差異表達(dá)的microRNAs，并通過(guò)RT-qPCR驗(yàn)證結(jié)果。利用GO-Analysis進(jìn)行生物信息學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)采用χ2檢驗(yàn)和fisher檢驗(yàn)的原理，計(jì)算得到

3、p值與p(k)值，后多重比較，得出GO-Analysis的誤判率（FDR），根據(jù)FDR值判斷差異是否具有顯著性；Pathway-Analysis是應(yīng)用fisher精確檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)對(duì)microRNAs可能參與的所有Pathway進(jìn)行分析。
　　2、熒光素酶報(bào)告法檢測(cè)rno-let-7d可以調(diào)控靶基因PIK3IP1：rno-let-7d為異氟醚暴露后大鼠皮層表達(dá)發(fā)生變化的miRNA之一，利用 targetscan軟件預(yù)測(cè)到rno-l

4、et-7d可能參與調(diào)控靶基因PIK3IP1，通過(guò)PIK3IP13’UTR預(yù)測(cè)靶點(diǎn)構(gòu)入熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，利用rno-let-7d mimics及陰性對(duì)照microRNA-NC分別和PIK3IP1野生型靶標(biāo)共轉(zhuǎn)做雙熒光檢測(cè)，轉(zhuǎn)染48h后觀察細(xì)胞狀態(tài)并拍照，并裂解細(xì)胞，測(cè)試luciferase活性。
　　結(jié)果：MicroRNA芯片檢測(cè)結(jié)果顯示在不同濃度異氟醚暴露后中大鼠皮層共有29個(gè)microRNAs發(fā)生了表達(dá)變化具有顯著性：其中在2.

5、0%異氟醚吸入組（P1組）中19個(gè)，1.5%異氟醚吸入組（P2組）13個(gè)，0.75%異氟醚吸入組（P3組）4個(gè)（三組部分重疊）。通過(guò)隨機(jī)挑選的部分表達(dá)差異具有顯著性miRNAs進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)證明microRNA芯片結(jié)果是真實(shí)有效。這些microRNAs參與調(diào)控以下信號(hào)通路如Metabolic pathways（代謝途徑）、MAPK信號(hào)通路（MAPK signaling pathway）、T細(xì)胞受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑（T cell rec

6、eptor signaling pathway）、PI3K-Akt信號(hào)傳導(dǎo)途徑（PI3K-Akt signaling pathway）、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)通路（Neurotrophin signaling pathway）等。let-7d為異氟醚暴露后大鼠皮層表達(dá)發(fā)生變化的microRNA之一，通過(guò) let-7d mimics表達(dá)后測(cè)試luciferase活性發(fā)現(xiàn)，其對(duì)PIK3IP13’UTR有抑制作用，從而證實(shí)PIK3IP1是let-7