桑白盾蚧病原真菌SimplicilliumlanosoniveumTYL001菌株的研究.pdf

1、桑白盾蚧Pseudaulacaspispentagona(Targioni-Tozzetti)是世界性的花木和經(jīng)濟林木的害蟲。該蟲在我國北方一年發(fā)生3代，以受精雌成蟲過冬，4月下旬將卵產(chǎn)于介殼下，5月中、下旬1齡若蟲爬出介殼，在樹枝干上活動擴散，選擇合適位置固定，口針刺入樹皮內(nèi)吸食汁液，蟲體開始分泌蠟絨，逐漸形成介殼。蠟殼具有保護功能，使化學藥物不易滲透，防治十分困難。本研究對山西省太原市綠化樹木白蠟樹上的桑白盾蚧進行觀察研究，分離獲得

2、了病原真菌，并進行了一系列的病理學研究，為生物防治提供依據(jù)。
　　研究內(nèi)容：
　　1、桑白盾蚧各齡期發(fā)育及顯微形態(tài)特征的觀察，并制作各齡期永久玻片標本；
　　2、桑白盾蚧自然感染死亡的特征觀察、蟲尸收集、病原真菌的分離、純化、回接殺蟲實驗、病原菌株TYL001的顯微和超微形態(tài)特征的觀察及物種鑒定、菌株的基因序列（ITS、線粒體小rRNA亞基(rns)、線粒體NADH脫氫酶亞基3(nad3)）測定、系統(tǒng)發(fā)育樹的構建及菌種

3、的分子鑒定；
　　3、TYL001菌株5種不同濃度的孢子懸浮液（1.0×106孢子/mL、5.0×106孢子/mL、1.0×107孢子/mL、5.0×107孢子/mL、1.0×108孢子/mL）侵染桑白盾蚧雌成蟲，研究桑盾蚧的感染率和感染中時；利用光學顯微、掃描電鏡和透射電鏡技術觀察病原真菌對桑白盾蚧的侵染過程與病理學特征；以桑白盾蚧雌成蟲體壁作為菌株的唯一碳源制作液體培養(yǎng)基，研究真菌降解體壁時3種胞外酶（脂肪酶、類枯草桿菌蛋白酶

4、、幾丁質酶）的酶活性變化。
　　研究結果：
　　1、桑白盾蚧雌成蟲介殼與樹體接觸緊密，介殼呈圓形或橢圓形，灰白色，有明顯的螺旋紋，背面隆起；桑白盾蚧雌成蟲的蟲體寬梨形或短卵形，顏色從淡黃色至橘黃色，長約1mm，觸角、足、眼睛退化，體表分布多種腺體及剛毛。
　　雌蟲產(chǎn)卵時，圍陰腺分泌蠟絲保護卵粒，防止粘連；產(chǎn)卵后，蟲體縮向頭部，干癟死亡；卵呈橢圓形，粉色至橘粉色。
　　初孵若蟲呈藕粉色，扁橢圓形，光學顯微鏡下可清楚

5、看到一齡若蟲的眼、觸角、足、尾絲的形態(tài)；觸角6節(jié)，兩眼間有兩個腺孔明顯，腹末有2根尾絲。
　　二齡若蟲的眼、觸角、足、尾絲全部退化，外部形態(tài)與雌成蟲基本相似，但是， 圍陰腺還未形成。
　　2、在采集的桑白盾蚧上觀察發(fā)現(xiàn)自然感染死亡的蟲體，蟲體自然感染真菌各時期的體色不同，分別為：感染初期發(fā)白、感染中期棕黃色、感染后期棕褐色，蟲體表面附有菌絲；發(fā)病初期和中期的蟲體還能看出明顯具有體液，發(fā)病后期變的干癟。
　　用

6、接種環(huán)直接取自然感染死亡蟲尸上的真菌孢子，劃線培養(yǎng)于平板培養(yǎng)基上，經(jīng)過多次分離純化，得到一株菌絲為白色的病原真菌，命名為：TYL001菌株。
　　利用TYL001菌株制備孢子懸浮液（1.0×108孢子/mL），對桑白盾蚧雌成蟲作回接殺蟲實驗，結果顯示，蚧蟲體表出現(xiàn)與自然染菌死亡蟲尸同樣的癥狀。說明TYL001菌株是致死桑白盾蚧的病原真菌。
　　TYL001菌株的形態(tài)特征：分生孢子梗著生于菌絲上，多為單生，少量對生，輪生結構很

7、少出現(xiàn)，剛長出的孢子以粘連球狀著生于分生孢子梗上，成熟后，以單個孢子存在。據(jù)此形態(tài)特征，鑒定該菌株屬于蟲草科Cordycipitaceae。
　　TYL001菌株的序列測定與分子鑒定：測定的三條序列在NCBI網(wǎng)頁上進行Blast比對，ITS序列與Simplicilliumsp.（序列號：FJ948132）的相似率為99％；rns序列與Simplicilliumlanosoniveum（序列號：EF513006）的相似率為97%；n

8、ad3序列與Simplicilliumlanosoniveum（序列號：EF512887）的相似性為92%。結合形態(tài)學特征和分子鑒定結果，確定TYL001菌株為Simplicilliumlanosoniveum。
　　3、5種濃度的孢子懸浮液感染桑白盾蚧后，感染率隨孢子濃度的增加依次為：80%、83.33%、86.67%、90%、93.33%，感染中時隨孢子濃度增加依次為：101.1h、95.0h、94.2h、85.5h、82.5

9、h。
　　感染過程與病理學：用TYL001菌株的孢子懸浮液（1×108孢子/mL）侵染桑白盾蚧雌成蟲，分生孢子最易附著在口器、背管、陰門、圍陰腺、肛門及臀板節(jié)間處；孢子萌發(fā)形成芽管，再形成菌絲，菌絲可以從與外界相通的口器、背管、陰門、圍陰腺、肛門等部位侵入，或利用其機械壓力和自身分泌的胞外酶的作用，穿透桑白盾蚧體壁；菌絲進入血腔后，感染血細胞和肌肉等組織，大量生長、繁殖；待蟲體內(nèi)的營養(yǎng)耗盡，菌絲沖破體壁，擴散到體表，整個蟲體被菌絲