轉(zhuǎn)膜肽TAT滯育激素融合肽及其轉(zhuǎn)基因煙草對棉鈴蟲幼蟲的生長抑制作用.pdf

1、滯育是一些昆蟲在準(zhǔn)備抵抗不利條件時表現(xiàn)出來的生長停滯，滯育激素（DH）起誘導(dǎo)或解除滯育的作用取決于昆蟲的種類。本試驗首先設(shè)計了 TAT-caDH融合肽，借助TAT的高效跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，嘗試通過取食途徑將DH作用于害蟲，分析 TAT融合對保持 DH生物活性的作用；然后將 TAT-caDH融合肽在煙草體內(nèi)表達，分析在煙草中表達的生物活性，完成基于DH構(gòu)建新型殺蟲基因的研究，探討 TAT-caDH融合基因作為新型抗蟲基因應(yīng)用的可行性。研究得到以

2、下結(jié)論：
　?。?）融合多肽 TAT-caDH具有解除棉鈴蟲蛹滯育的活性；棉鈴蟲取食后，可以經(jīng)消化道橫向跨膜運輸?shù)竭_蟲體其它組織。在適宜棉鈴蟲幼蟲生長的條件下（27℃，光周期：L:D=（14:10）h），以及在誘導(dǎo)滯育的條件下（20℃，光周期：L:D=（10:14）h），融合肽 TAT-caDH飼喂棉鈴蟲幼蟲后，均可以抑制幼蟲的生長發(fā)育。處理組幼蟲取食TAT-caDH后的歷期分別為22±2.3d和50±11.4d，顯著長于對照組（

3、P<0.01），對照組分別為19±1.3d和38±18.9d；處理組化蛹率分別為76.9±2.2％和64±4.3%，顯著低于對照組（ P<0.01），對照組分別83±3.9%和79±2.1%。兩種生長條件下的蛹重和誘導(dǎo)滯育條件下的滯育率與對照組之間沒有顯著性差異。與此同時，取食 caDH的幼蟲在幼蟲歷期、化蛹率、蛹重和誘導(dǎo)滯育條件下的滯育率與對照組間均無顯著性差別。
　?。?）通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法對煙草進行了遺傳轉(zhuǎn)化。分化培養(yǎng)基

4、采用的是MS基本培養(yǎng)基，添加終濃度0.05mg/L NAA、0.05mg/L6-BA和0.01mg/L TDZ；通過50mg/L的卡納霉素（km）在分化和生根階段篩選，獲得6棵抗性苗；用特異的引物對抗性苗基因組 DNA進行 PCR分子擴增，挑選出3棵為陽性的轉(zhuǎn)基因煙草；Q-PCR試驗結(jié)果表明3棵陽性苗在 mRNA表達水平并不一致，之間差別分別是4.1倍、1.9倍和1倍；western蛋白免疫印跡結(jié)果證明了3棵陽性苗均正確表達出了TAT-

5、caDH融合蛋白。
　?。?）挑選生長良好的 TAT-caDH轉(zhuǎn)基因株系1和轉(zhuǎn)基因株系2飼喂棉鈴蟲3齡幼蟲。在27℃，光周期：L:D=（14:10）h條件下，幼蟲飼喂轉(zhuǎn)基因株系1和轉(zhuǎn)基因株系2葉片，2d后體重分別為45.1±4.0mg和61.5±6.1mg，4d后體重104.8±8.5mg和121.9±13.3mg，顯著小于對照組2d和4d的體重（分別為81.1±5.8mg和151.1±9.9mg），TAT-caDH轉(zhuǎn)基因煙草對取

6、食幼蟲生長表現(xiàn)出顯著的抑制作用；在20℃，光周期：L:D=（10:14）h條件下，棉鈴蟲幼蟲生長緩慢，幼蟲飼喂轉(zhuǎn)基因株系1和轉(zhuǎn)基因株系2葉片，12d后體重分別72.9±5.7mg和62.2±8.2mg，16d后分別為104.7±8.9mg和121.9±15.0mg，20d后分別為167.2±15.2mg和171.5±19.2mg，均低于同時期對照組體重（80.5±7.9mg、122.0±8.6mg和191.9±12.9mg），幼蟲體重間