從細胞周期調(diào)控探討益氣活血方防治球囊損傷血管狹窄的機理.pdf

1、研究背景：冠心病是嚴(yán)重威害中老年人健康的一種常見、多發(fā)心血管疾病。在冠心病治療中，冠狀動脈介入治療已具有越來越重要地位。由于介入治療術(shù)后部分患者出現(xiàn)原先擴張的冠狀動脈再狹窄，常需要再行PTCA或CABG，給患者帶來巨大經(jīng)濟和心理負擔(dān)。針對RS防治措施，一直是國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界長期探索的熱點。隨著支架置入術(shù)、血管內(nèi)照射、藥物涂層支架置入術(shù)等新技術(shù)先后廣泛應(yīng)用，逐漸顯示出解決其難題的良好前景，但仍然不能完全解決所有支架內(nèi)再狹窄，另外費用昂貴、遠期

2、療效、安全性等諸多問題，還有待大規(guī)模臨床試驗證實。 在此背景下，應(yīng)用祖國醫(yī)學(xué)理論，探索防治RS這種新的醫(yī)源性疾病同樣受人關(guān)注。以中醫(yī)理論為指導(dǎo)，我們認為RS患者具有“胸痹心痛病”及“導(dǎo)管外源機械挫傷”耗氣傷血的雙重特點，起病及病理演變“氣虛血瘀”貫穿始終，從而推論“益氣活血”治則應(yīng)在防治該病中占有重要地位。在此基礎(chǔ)上，優(yōu)化選擇具有抑制VSMCs增殖、減緩動脈內(nèi)皮脫落后血管內(nèi)膜增生等多種防治心血管疾病藥效作用的“益氣活血”中藥，組

3、成小復(fù)方制劑——益氣活血方。 研究目的：其一尋求RS防治的有效中藥，力求通過血管VSMCs周期調(diào)控分子，解釋其抑制細胞增殖的藥效機制；其二通過比較單純活血、單純益氣及益氣活血三種中醫(yī)治則指導(dǎo)組方干預(yù)損傷血管狹窄，為中醫(yī)防治RS理論提供實驗依據(jù)。 研究方法：益氣活血方的由黃芪25g、川芎15g、三七5g配伍組成，經(jīng)煎煮等工藝，制成0.45g/ml(每100ml溶液含生藥45g，益氣活血方小劑量組)、0.9g/ml(每100

4、ml溶液含生藥90g，益氣活血方大劑量組)濃度的湯藥；黃芪組由益氣活血方大劑量組去川芎、三七而成，濃縮制成0.5g/m1(每100ml溶液含生藥50g)；缺黃芪組組(或稱益氣活血方缺黃芪)，由益氣活血方大劑量組去黃芪而成，制成0.4g/ml(每100ml溶液含生藥40g)。 清潔級雄性SD大鼠72只，體重350-450g；適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。根據(jù)隨機數(shù)字表法將動物隨機分成對照組(手術(shù)對照組)、模型組、黃芪組、缺黃芪組、益氣活血方小劑

5、量組和益氣活血湯大劑量組共6組，用Fogarty2F球囊導(dǎo)管，實施股動脈插入球囊導(dǎo)管損傷頸總動脈大鼠，手術(shù)前一天開始依動物體重，益氣活血方大劑量組以3.6275g/kg每日灌胃一次，其他中藥組給予相應(yīng)劑量藥物，對照組、模型組給予生理藥水，連續(xù)治療5天和28天后處死動物取材、切片。 實驗內(nèi)容1.觀察各組第28天損傷血管蘇木素—伊紅(HE)和TR-A02彈力纖維染色組織病理變化，評價球囊損傷大鼠頸總動脈狹窄模型的建立及益氣活血方對損

6、傷血管內(nèi)膜增殖的影響；2.用免疫組織化學(xué)的方法，檢測損傷第5天各組血管壁PCNA的表達；3.用免疫組化的方法，檢測第5天各組損傷血管壁三種重要的細胞周期蛋白cyclinA、D1和E的表達；4.用免疫組化的方法，檢測第5天各組損傷血管壁兩種重要的細胞細胞周期依賴性蛋白激酶CDK2和CDK4的表達；5.用免疫組化的方法，檢測第5天各組損傷血管壁三種重要的細胞細胞周期蛋白依賴激酶抑制蛋白P16、P21和P27的表達；6.用逆轉(zhuǎn)錄—多聚酶鏈?zhǔn)椒?/p>

7、應(yīng)(RT-PCR)的方法，檢測第5天損傷血管壁p21waf1mRNA表達。數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS12.0軟件包，進行多個樣本間兩兩比較的方差分析處理。 實驗結(jié)果：1.(1)成功復(fù)制經(jīng)股動脈球囊導(dǎo)管損傷頸總動脈模型：第28天模型組明顯內(nèi)膜不規(guī)則增生，管腔顯著狹窄，血管表面不光滑，大量細胞過度增殖遷移跨過內(nèi)彈力板至內(nèi)膜，使內(nèi)膜厚度多超過中膜厚度，內(nèi)彈力板斷裂，中外膜亦可見不同程度的增厚及彈力纖維成分增生；(2)中藥各組對血管球囊損傷后

8、內(nèi)膜增生有明顯的抑制作用：益氣活血方大、小劑量組與缺黃芪組和黃芪組療效差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)，益氣活血方大、小劑量組抑制內(nèi)膜增殖未見量效關(guān)系，抑制內(nèi)膜增生作用各組強弱依次為益氣活血方大劑量組和益氣活血方小劑量組、缺黃芪組，黃芪組對內(nèi)膜增生抑制作用最弱。(3)球囊擴張術(shù)各組大鼠5天后與對照組結(jié)果比較：擴張后動脈內(nèi)、外彈力板周長增加，管徑明顯增大(P＜0.05)，但擴張術(shù)后各組動物動脈管徑之間差異不明顯，具有可比性。

9、2.益氣活血方及其拆方對頸總動脈球囊損傷后第5天VSMCs表達PCNA有明顯的抑制作用：與模型組相比，中藥各組血管壁內(nèi)PCNA表達陽性的VSMCs明顯減少(P＜0.01)，益氣活血方大、小劑量組與缺黃芪組和黃芪組之間，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)；益氣活血方大、小劑量組兩組之間PCNA表達陽性的VSMCs無差異；各組作用強弱依次為益氣活血方大劑量組和益氣活血方小劑量組、缺黃芪組，黃芪組對細胞增生抑制作用最弱。對照組的血

10、管組織表達陽性VSMCs的量非常低；與對照組相比，球囊擴張術(shù)各組(模型組和中藥各組)大鼠，PCNA表達陽性的VSMCs明顯增多(P＜0.01)。3.益氣活血方及其拆方對頸總動脈球囊損傷后血管VSMCs表達cyclinA、D1和E有明顯的抑制作用：三種cyclins在對照組表達量最低，模型組最高，與中藥各組比較，有顯著統(tǒng)計學(xué)意義，(P＜0.01)；益氣活血方大、小劑量組與缺黃芪組和黃芪組之間，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；益氣活血方大

11、、小劑量組兩組之間三種cyclins表達陽性VSMCs無差異；各組作用強弱依次為：益氣活血方大劑量組和益氣活血方小劑量組、缺黃芪組，黃芪組對抑制作用最弱；三種cyclins的變化趨勢基本一致，幅度cyclinD1稍大，cyclinE略低。4.益氣活血方及其拆方對頸總動脈球囊損傷后VSMCs表達CDK2和CDK4有明顯的抑制作用：對照組的血管組織CDD2和CDK4的表達陽性VSMCs的量非常低；球囊擴張術(shù)各組(模型組和中藥各組)大鼠，可見

12、血管明顯增多CDK2和CDK4表達陽性的VSMCs(P＜0.01)，且CDD2在損傷后表達增加略多于CDK4；與模型組相比，中藥各組血管組織CDK2和CDK4表達陽性VSMCs較少(P＜0.01)；特別是益氣活血方大、小劑量組，與缺黃芪組和黃芪組之間，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)；益氣活血方大、小劑量組兩組之間CDK2和CDK4表達陽性VSMCs無差異。各組作用強弱依次為益氣活血方大劑量組和益氣活血方小劑量組、缺黃芪組

13、，黃芪組對損傷誘導(dǎo)CDK2和CDK4上升的抑制作用最弱。相對而言，CDK2在各組中變化幅度要大于CDK4。5.益氣活血方對頸總動脈球囊損傷后VSMCsP16、p21和p27有上調(diào)作用：對照組的血管組織可見p27表達陽性的VSMCs，相對而言，p21表達陽性的VSMCs量非常低，未見P16在對照組的VSMCs中表達；在球囊擴張術(shù)各組大鼠，均可見血管VSMCs表達一定量的P16、p21和p27；在球囊擴張術(shù)各組與對照組比較，P16、p21在

14、VSMCs細胞中的表達增加(P＜0.01)，而p27在模型組VSMCs細胞中的表達下降，但其無變化差異(P＞0.05)；與模型組比較，中藥各組P16在VSMCs細胞中的表達更多(P＜0.01)；p27、p21在VSMCs細胞中的表達較模型組多僅見于益氣活血方大、小劑量組(P＜0.01)，而缺黃芪組和黃芪組p27變化無差異(P＞0.05)；益氣活血方大、小劑量組P16、p21和p27在VSMCs細胞中的表達最高，與其他各組比較，均有顯著差

15、異(P＜0.01)；益氣活血方大小劑量組P16、p21和p27表達程度無統(tǒng)計差異(P＞0.05)。6.用逆轉(zhuǎn)錄—多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)的方法，證實第5天各組血管組織存在p21waflmRNA的表達。 結(jié)論：1.球囊導(dǎo)管經(jīng)股動脈損傷頸總動脈的動物模型，國內(nèi)尚無報道。實驗第28天組織病理學(xué)表現(xiàn)為：明顯內(nèi)膜不規(guī)則增生，管腔顯著狹窄，血管表面不光滑，大量細胞過度增殖遷移跨過內(nèi)彈力板至內(nèi)膜，內(nèi)彈力板斷裂，中外膜亦可見不同程度的增厚

16、及彈力纖維成分增生，證實造模成功。2.組織病理學(xué)觀察證實：第28天益氣活血方及其拆方對血管球囊損傷后內(nèi)膜增生有明顯的抑制作用，抑制內(nèi)膜增生作用各組強弱依次為益氣活血方大劑量組和益氣活血方小劑量組、缺黃芪組，黃芪組對內(nèi)膜增生抑制作用最弱。但益氣活血方大、小劑量組抑制內(nèi)膜增殖未見量效關(guān)系。3.未損傷大鼠頸總動脈血管存在低表達量的PCNA、CDK2、CDK4和p21，較低表達量的cyclinA、D1、E和p27，而無P16表達；球囊損傷第5天

17、，可誘導(dǎo)損傷血管除P27以外的上述蛋白表達的上調(diào)，并且細胞周期正調(diào)節(jié)蛋白上升幅度明顯較負調(diào)節(jié)蛋白大。4益氣活血方及其拆方抑制內(nèi)膜增生機理與其在損傷早期協(xié)調(diào)干預(yù)多種細胞周期調(diào)控蛋白表達有關(guān)。實驗證實：益氣活血方能抑制正調(diào)節(jié)蛋白cyclinA、D1、E及其催化亞基CDK2、CDK4和PCNA生成；促進細胞周期負調(diào)節(jié)蛋白P16、p21和p27的生成，阻止VSMCs增殖，從而防治球囊損傷血管后血管狹窄。5.首次采用其拆方研究，證實益氣活血方防治