星型膠質(zhì)細胞在不同接觸狀態(tài)下,CyclinA、CyclinD1與P27表達研究.pdf

1、接觸抑制現(xiàn)象具有重要的生理意義，其與機體內(nèi)器官，組織的形態(tài)、大小以及各類細胞數(shù)量的控制有著密切的關(guān)系。機體的組織器官生長到一定程度后會自然停止生長，而不是無限制的長大；在體外培養(yǎng)過程中，當細胞分裂增殖到一定程度，達到相互接觸時，細胞停止分裂。一般認為，接觸抑制是由于細胞數(shù)量的增加消耗了局部區(qū)域的促分裂因子；另一方面是細胞接觸時自身分泌了一些細胞增殖的抑制因子。2001年Nakatsuji Y等人的研究表明：星形膠質(zhì)細胞的接觸抑制是通過介

2、導細胞周期相關(guān)蛋白的表達而實現(xiàn)的，而細胞密度能夠調(diào)控一系列關(guān)鍵細胞周期蛋白水平的表達，可能是通過控制細胞周期的進程而實現(xiàn)。我們以星形膠質(zhì)細胞做為模型細胞，了解接觸抑制的機理并探討接觸抑制與細胞周期調(diào)控間的相互關(guān)系。
　　 細胞周期調(diào)控是細胞的基本生理功能，其不僅控制細胞的分裂增殖，而且決定著細胞的分化及死亡；同時，細胞周期調(diào)控對于細胞的許多重要生理功能亦有至關(guān)重要的作用。因此，有理由相信，在細胞生長發(fā)育的整個階段，都有可能在細胞

3、周期的調(diào)控下逐漸進展。細胞周期調(diào)節(jié)蛋白是一組功能各異、相互聯(lián)系、相互制約的核蛋白，按其對細胞周期的作用分為細胞周期正控蛋白（包括Cyclin、CDK和pRb）和細胞周期負控蛋白（CKI家族）。細胞周期蛋白Cyclin作為一類隨細胞周期變化而循環(huán)出現(xiàn)和消失的蛋白質(zhì)，它是從酵母到人類等真核生物中有廣泛作用的分子。Cyclin在正常細胞周期調(diào)控中有重要作用。目前在哺乳動物細胞中發(fā)現(xiàn)了20 多種Cyclin。對細胞周期有明確調(diào)控作用的主要是Cy

4、clinA、B、C、D和E，Cyclin分子在進化上有高度的保守性，其分子結(jié)構(gòu)上都有一段“Cyclin盒”序列，Cyclin通過與CDK形成復合物發(fā)揮調(diào)控細胞周期或轉(zhuǎn)錄的功能；CDK含量在細胞周期的各階段相對恒定，其活性由于Cyclin的調(diào)節(jié)作用有所變化，CDK 必須與相應的Cyclin 結(jié)合，并且在一定部位發(fā)生磷酸化或去磷酸化才能有活性或被滅活，Cyclin 及其相關(guān)分子是目前細胞周期調(diào)控研究中的熱點。細胞周期負控蛋白（CKI 家族）

5、包括P21，P27，P57等，可抑制已知的大多數(shù)Cyclin－CDK復合物的激酶活性，對G1期的早期與晚期、S 期等各期都有重要作用，且分布與功能在不同的細胞各異，是目前的主要研究對象。
　　 為了了解星形膠質(zhì)細胞在接觸抑制時相關(guān)的分子機制，我們選取三種細胞周期相關(guān)蛋白CyclinA、CyclinD1和P27 作為標志物，觀察它們在星形膠質(zhì)細胞增殖和接觸抑制過程中的表達情況，探討接觸抑制與細胞周期調(diào)控間的相互關(guān)系。
　　

6、 本研究在體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞的條件下，檢測其處于半?yún)R合狀態(tài)時，以及處于匯合狀態(tài)時CyclinA、CyclinD1與P27等三種蛋白的表達情況。將純化的星形膠質(zhì)細胞進行傳代培養(yǎng)，分別在其處于半?yún)R合狀態(tài)與匯合狀態(tài)時進行下述實驗。一、采用免疫組化染色，將半?yún)R合與匯合的細胞與上述三種蛋白的抗體反應，對結(jié)果進行定性分析并行統(tǒng)計學分析。二、采用RT-PCR技術(shù)，分別于半?yún)R合與匯合時期檢測上述三種蛋白mRNA的表達，將細胞裂解離心制成RNA樣品，逆

7、轉(zhuǎn)錄成cDNA，產(chǎn)物擴增，對其進行跑膠，顯影，并將結(jié)果進行統(tǒng)計學分析。免疫組化結(jié)果顯示：與半?yún)R合時細胞相比，星形膠質(zhì)細胞匯合時CyclinA表達顯著下降（p<0.05），CyclinD1表達顯著下降（p<0.05），而P27表達顯著升高(p<0.01)；RT-PCR結(jié)果顯示：與半?yún)R合時細胞相比，星形膠質(zhì)細胞在匯合時CyclinA mRNA表達顯著下降（p<0.01），CyclinD1 mRNA表達顯著下降（p<0.05），而P27 mR