動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)血管新生的基礎(chǔ)研究.pdf

1、研究背景
　　動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)斑塊的不穩(wěn)定所導(dǎo)致的斑塊破裂進(jìn)而繼發(fā)的血栓形成是引起急性心血管事件的最主要原因。近年研究證明，斑塊內(nèi)血管新生（neovascularization）與AS斑塊穩(wěn)定性密切相關(guān)。
　　血管新生受復(fù)雜機(jī)制的調(diào)控，在正常的機(jī)體中激活因子與抑制因子處于動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)，但在某些條件下，此平衡被打破，促血管新生的因子就會(huì)被激活，進(jìn)而促進(jìn)新生血管的形成。研究表明斑塊內(nèi)缺血、缺

2、氧以及炎癥反應(yīng)是引起AS斑塊內(nèi)血管新生的重要原因。大量研究證明斑塊不穩(wěn)定性與斑塊內(nèi)新生血管的數(shù)量增加密切相關(guān)。這是由于新生血管具有滲透性高、脆性大等特點(diǎn)。新生血管的高滲透性使其成為炎性因子和脂質(zhì)進(jìn)入斑塊內(nèi)的通道，加重了斑塊內(nèi)炎癥反應(yīng)與脂質(zhì)沉積。新生血管僅由一層內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成，具有脆性大的特點(diǎn)，易導(dǎo)致斑塊內(nèi)出血的發(fā)生，使斑塊成為不穩(wěn)定斑塊。但以上為不同學(xué)者在不同動(dòng)脈粥樣硬化階段中的不同研究中獲得的，缺乏系統(tǒng)的縱向研究觀察缺氧、炎癥因子的動(dòng)態(tài)

3、改變對(duì)斑塊內(nèi)血管新生的影響。
　　本研究擬動(dòng)態(tài)觀察動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞、炎癥因子、缺氧誘導(dǎo)因子、生長(zhǎng)因子和新生血管數(shù)量的變化趨勢(shì)以及其之間的相關(guān)性。
　　研究目的
　　1，明確在AS斑塊發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中缺氧與斑塊內(nèi)血管新生的關(guān)系。
　　2，明確在AS斑塊發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中炎癥與斑塊內(nèi)血管新生的關(guān)系。
　　方法
　　1模型的建立:60只三月齡純種新西蘭雄性大白兔，給予球囊拉傷+高膽固

4、醇飲食（1％膽固醇，每只120-140g/d），12周后改為普通飼料飲食，并分別于球囊拉傷后4周、6周、8周、10周、12周、14周、16周、18周、20周、22周及24周分別處死5只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。
　　2血液生化指標(biāo)及炎性因子的檢測(cè):分別于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，球囊拉傷后4周開(kāi)始，每?jī)芍苣┨幩?只動(dòng)物前作血液生化檢查。禁食12小時(shí)以上，測(cè)量體重后，經(jīng)耳緣靜脈抽取空腹血，留取血清檢測(cè)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)血清總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、甘

5、油三酯(TG)及高密度脂蛋白(HDL-C)。
　　3免疫組織化學(xué)染色以及斑塊形態(tài)學(xué)分析:從球囊拉傷后4周開(kāi)始，每?jī)芍茈S機(jī)安樂(lè)死5只實(shí)驗(yàn)兔，應(yīng)用RAM-11和CD31抗體檢測(cè)其腹主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中巨噬細(xì)胞和新生血管的數(shù)量及分布，利用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)斑塊內(nèi)CRP、ICAM-1、VCAM-1、TNF-α、HIF-1α、VEGF-A、PDGF-BB和FGF-2的表達(dá)情況，光鏡下所見(jiàn)黃褐色顆粒即為陽(yáng)性表達(dá)，用Imageproplus

6、6.0彩色顯微圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析IOD值。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每只實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)選取5張切片，測(cè)定陽(yáng)性染色積分光密度值(IOD)，其平均值作為每只實(shí)驗(yàn)兔的IOD值。IOD值越高表明組織內(nèi)RAM-11、ICAM-1、VCAM-1、TNF-α、CRP、HIF-1α、VEGF-A、PDGF-BB、FGF-2的含量越高。斑塊內(nèi)新生血管的測(cè)定，每組隨機(jī)選取5張DAB切片，數(shù)每張切片斑塊內(nèi)CD31表達(dá)的環(huán)狀的個(gè)數(shù)，取5張切片的平均值作為每組的CD31表達(dá)

7、量。
　　4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，并采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。多組間的比較用單因素方差分析。使用相關(guān)性分析分析兩組數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性，P＜0.05時(shí)，表明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般情況
　　實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，所有實(shí)驗(yàn)兔在球囊拉傷手術(shù)后均恢復(fù)良好，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中一般狀態(tài)良好，無(wú)疾病以及死亡的出現(xiàn)。
　　2.各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)兔血液生化指標(biāo)

8、
　　各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)兔TC，LDL水平都在12周達(dá)到高峰，第12周TC、LDL分別是
　　4周的2.5倍與2倍，12周后由高膽固醇飲食替換為普通飲食，此后TC與LDL開(kāi)始下降，到24周逐漸恢復(fù)至基線水平，但HDL與TG在整個(gè)過(guò)程中無(wú)明顯變化。
　　3.組織病理學(xué)染色。
　　HE染色可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)兔斑塊從4周開(kāi)始至24周逐漸增大，8周時(shí)可見(jiàn)斑塊內(nèi)有少量紅細(xì)胞出現(xiàn)，提示可能在球囊拉傷后8周時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)斑塊內(nèi)新生血管。
　

9、　4.免疫組織化學(xué)染色
　　RAM-11染色可見(jiàn)從4周起斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，至12周達(dá)到最高峰后開(kāi)始回落。免疫組織化學(xué)染色可見(jiàn)從4周到24周斑塊內(nèi)ICAM-1、VEGF-A、TNF-α、HIF-1α、FGF-2表達(dá)呈現(xiàn)出同樣趨勢(shì)。而斑塊內(nèi)VCAM-1、CRP的表達(dá)也在12周達(dá)到高峰，但隨后其表達(dá)量并未回落，依然高水平表達(dá)。PDGF-BB染色顯示斑塊內(nèi)PDGF-BB的表達(dá)從4周開(kāi)始逐漸緩慢增加至24周達(dá)到高峰。CD31染色證

10、實(shí)第8周末于斑塊基底部（內(nèi)彈力板處）開(kāi)始出現(xiàn)新生血管，隨斑塊增大及炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，斑塊內(nèi)新生血管數(shù)量逐漸增多，并逐漸向內(nèi)皮下生長(zhǎng)。
　　在斑塊的早期（4周至12周），相關(guān)性分析顯示HIF-1α的表達(dá)與CD31相關(guān)(r=0.469，p＜0.05)，與VEGF-A也密切相關(guān)(r=0.625，p＜0.05);而在斑塊的進(jìn)展期（14周至24周），HIF-1α的表達(dá)量明顯減少，且與CD31無(wú)相關(guān)。在斑塊形成的早期（4周至12周）ICAM-1、

11、VCAM-1二者與斑塊內(nèi)血管新生密切相關(guān)(r=0.550,P＜0.05;r=0.762,P＜0.05),ICAM-1、VCAM-1、TNF-α、CRP四者都與VEGF-A、FGF-2，PDGF-BB密切相關(guān)。而球囊拉傷后14-24周，以上因子間均無(wú)相關(guān)性。
　　結(jié)論
　　1、本實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)了在新西蘭大白兔動(dòng)脈粥樣硬化模型中，于球囊拉傷加高脂飲食后第8周末可見(jiàn)斑塊內(nèi)開(kāi)始有新生血管的出現(xiàn)，新生血管早期在缺氧、炎癥等因素作用下，自

12、外膜向內(nèi)皮下生長(zhǎng)。
　　2、缺氧可能通過(guò)HIF-1α-VEGF-A通路來(lái)促進(jìn)斑塊內(nèi)的血管新生，但缺氧只在斑塊形成的早期起到促進(jìn)血管新生的作用。
　　3、在斑塊形成階段，炎癥可以通過(guò)多種促生長(zhǎng)因子如VEGF-A、FGF-2和PDGF-BB發(fā)揮促進(jìn)斑塊內(nèi)血管新生作用。
　　4、VEGF-A和FGF-2主要發(fā)揮促進(jìn)僅由簡(jiǎn)單的內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成，沒(méi)有基底膜與周圍結(jié)締組織支撐的不成熟新生血管，而PDGF-BB則可通過(guò)募集周細(xì)胞而發(fā)揮促