基于發(fā)卡結(jié)構(gòu)自組裝的適體傳感器用于檢測藥物小分子——腺苷.pdf

1、生物傳感器是一種能將生物識別過程轉(zhuǎn)換為可檢測信號的裝置，主要包括兩個重要的功能性組件:目標物識別組件和信號轉(zhuǎn)導組件。其中，目標物識別組件是影響其傳感性能的核心元素。近年來，適體以其高親和力、高特異性以及廣泛目標物等特點引起了人們越來越多的研究興趣和關(guān)注。以適體為識別元件的傳感器即適體傳感器逐漸成為生命科學的研究熱點和研究重點。由于靈敏度高、響應快速和操作簡單的優(yōu)勢，熒光法已作為信號轉(zhuǎn)導元件廣泛用于各類適體傳感器中。因此，本文的研究工作主

2、要集中于如何在現(xiàn)有生物學分析技術(shù)基礎上構(gòu)建新型的熒光適體傳感器。
　　腺苷是一種重要的生物藥物小分子，參與機體多種生命活動的調(diào)節(jié)，具有重要的生理和藥理作用，如舒張血管、收縮平滑肌以及對神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用，是治療陣上性心動過速(PSVT)的一線藥物[132-136]。此外，生物樣本中腺苷的檢測可用于疾病診斷、病程的監(jiān)測以及癌癥的早期診斷[137-139]。因此對腺苷的定量檢測，尤其是生物樣本中腺苷的檢測在臨床研究、疾病的診

3、斷和預防以及癌癥的早期診斷等方面具有重要的意義。
　　自腺苷適體被篩選出來后，基于適體傳感器的腺苷檢測法得以快速發(fā)展。然而，現(xiàn)有的腺苷適體傳感系統(tǒng)靈敏度往往不夠理想，且不能直接用于復雜生物樣本中腺苷的定量檢測。因此，進一步提高腺苷檢測的靈敏度和實現(xiàn)生物樣本中的直接檢測是現(xiàn)在腺苷適體傳感器所面臨的重大挑戰(zhàn)。本文中我們利用恒溫、無酶的信號放大技術(shù)——發(fā)卡結(jié)構(gòu)自組裝，構(gòu)建了新型的熒光適體傳感器，提高了腺苷的檢測靈敏度，實現(xiàn)了生物樣本中腺

4、苷的分析檢測。
　　第一章首先對生物傳感器進行了綜述，尤其是熒光適體傳感器的特點、優(yōu)勢及發(fā)展。其次，概述了現(xiàn)有的幾類等溫信號放大技術(shù)，重點介紹了基于發(fā)卡結(jié)構(gòu)自組裝的無酶信號放大技術(shù)。隨后，對腺苷的重要生理和藥理作用進行了介紹。最后，就腺苷適體傳感器的發(fā)展和面臨的挑戰(zhàn)進行了概述。
　　第二章構(gòu)建了基于發(fā)卡結(jié)構(gòu)自組裝的新型適體傳感系統(tǒng)，成功實現(xiàn)了腺苷的無酶、免標記和雙重放大的分析檢測。通過設計將雜交鏈式反應(HCR)引物鏈部分封

5、閉在發(fā)卡H2中，將G-四分體序列分別連接在發(fā)卡H3的兩端。腺苷的加入可以觸發(fā)發(fā)卡H1和H2進行催化自組裝反應(CHA)，實現(xiàn)信號的第一步放大;CHA產(chǎn)物所暴露出的HCR引物鏈可以進一步觸發(fā)H3和H4進行HCR擴增，實現(xiàn)信號的第二步放大。HCR反應后，原來分為兩段的G-四分體序列可以形成完整的G-四分體結(jié)構(gòu)，插入熒光染料NMM后實現(xiàn)檢測。在最優(yōu)實驗條件下，該方法對腺苷的線性范圍為5.0×10-6molL-1-2.0×10-4molL-1，

6、檢測限為9.7×10-7molL-1。該檢測限較Yu課題組酶輔助放大的腺苷適體傳感器降低了約12倍[150]，較本課題組之前構(gòu)建的無酶、放大的腺苷適體傳感器降低了約6倍[115]。所構(gòu)建的適體傳感器能實現(xiàn)均相中腺苷的無酶、免標記和雙重放大的定量檢測，靈敏度高、特異性好，具有在復雜生物基質(zhì)中應用的潛能。
　　雖然我們構(gòu)建的腺苷適體傳感器的靈敏度得到了顯著提高，但是該靈敏度仍舊不夠理想，不能用于生物樣本的直接分析檢測。為此，我們開展了

7、下一個工作。第三章構(gòu)建了基于共區(qū)域化觸發(fā)HCR的腺苷適體傳感器，可以用于生物樣本中腺苷的直接檢測。在該體系中，首先將腺苷適體截為兩半，分別連有粘性末端區(qū)域和鏈置換區(qū)域，通過腺苷的“粘合”作用使得兩個適體片段結(jié)合，從而實現(xiàn)粘性末端區(qū)域和鏈置換區(qū)域的共區(qū)域化，形成完整的引物鏈，觸發(fā)HCR反應。在最優(yōu)實驗條件下，該方法對腺苷的線性范圍為1.0×10-6molL-1-1.2×10-4molL-1，檢測限為2.0×10-7molL-1，較Yu課題