青藏高原不同地區(qū)垂穗披堿草青貯飼料中乳酸菌多樣性及優(yōu)勢菌種的發(fā)酵特性研究.pdf

1、本研究采用真空袋法對青藏高原四個(gè)不同地區(qū)（天祝、果洛、當(dāng)雄、那曲）的垂穗披堿草（Elymus nutans）進(jìn)行青貯，并通過第三代16S全長高通量測序（PacBioⅡ平臺）對青藏高原四個(gè)地區(qū)及不同發(fā)酵階段（14、30、60、90天）垂穗披堿草青貯飼料發(fā)酵體系中的微生物（細(xì)菌）多樣性進(jìn)行了研究；同時(shí)，對不同發(fā)酵階段青貯飼料中的優(yōu)勢乳酸菌進(jìn)行分離鑒定、產(chǎn)酸能力和耐低溫能力的篩選研究；將表現(xiàn)優(yōu)良的乳酸菌作為青貯飼料乳酸菌添加劑添加到垂穗披堿草

2、中，在10、15、25℃條件下進(jìn)行青貯發(fā)酵，研究其對青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響，以期為開發(fā)適合青藏高原地區(qū)青貯用乳酸菌添加劑提供理論依據(jù)，試驗(yàn)結(jié)果如下：
　　1.青藏高原四個(gè)不同地區(qū)垂穗披堿草青貯飼料中的微生物多樣性存在明顯的差異，并且各地區(qū)垂穗披堿草青貯飼料發(fā)酵體系中微生物的多樣性隨青貯時(shí)間的演替特征也各不相同。就乳酸菌而言，通過高通量測序得知青藏高原垂穗披堿草青貯飼料中的乳酸菌主要包括6個(gè)屬，分別為腸球菌屬（Enterococcus）

3、、乳桿菌屬（Lactobacillus）、片球菌屬（Pediococcus）、明串珠屬（Leuconostoc）、魏斯氏菌屬（Weissella）和乳球菌屬（Lactococcus）；這6個(gè)屬的乳酸菌鑒定到種水平的有植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、蒙氏腸球菌（Enterococcus mundt

4、ii）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、腸膜明串珠（Leuconostoc mesenteroides）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）等28個(gè)種。
　　2.由于地理、氣候條件的差異，青藏高原不同的采樣地點(diǎn)采集到的垂穗披堿草附著的乳酸菌也存在明顯的差異。天祝地區(qū)鮮樣中的微生物主要為假單胞菌屬（Pseudomonas，45％）和泛菌屬（Pantoea，17%），乳酸菌主要為食竇魏斯氏菌（4.

5、21%）和腸膜明串珠菌（1.03%），其他乳酸菌比例較??；果洛的鮮樣中以乳桿菌（45.8%）和腸球菌（33.3%）為主；當(dāng)雄地區(qū)的鮮草中主要是食竇魏斯氏菌，占整個(gè)細(xì)菌豐度的94.46%；那曲地區(qū)鮮樣中的優(yōu)勢菌以占比60%的腸膜明串珠菌為主。
　　3.同一地區(qū)采集的垂穗披堿草在不同發(fā)酵階段其樣品中微生物種類不同。就乳酸菌而言，天祝地區(qū)樣品發(fā)酵至60天時(shí)雜菌才被乳酸菌取代，分別有52%的戊糖片球菌，21%的乳桿菌和15%的腸膜明串珠菌

6、。發(fā)酵90天后腸膜明串珠菌占比31.97%，棒狀乳桿菌占比24.32%，戊糖片球菌占19.67%。從果洛地區(qū)可明顯的看出乳桿菌在整個(gè)青貯階段都發(fā)揮著主導(dǎo)作用，尤其是短乳桿菌在14、60、90天分別占比60.19%、71.02%、73.76%。當(dāng)雄地區(qū)草樣在發(fā)酵開始后魏斯氏菌的優(yōu)勢地位被乳桿菌和明串珠菌代替，在發(fā)酵14天時(shí)乳桿菌占51.68%，30天時(shí)升至60.87%，60天時(shí)短乳桿菌高達(dá)82.75%，90天時(shí)乳桿菌占59.61%。那曲地

7、區(qū)的鮮樣發(fā)酵14天后食竇魏斯氏菌占33.83%，發(fā)酵中后期乳桿菌占比47.51%、73.57%、68.87%。
　　4.本試驗(yàn)從不同地區(qū)不同發(fā)酵階段的垂穗披堿草青貯飼料中共分離得到優(yōu)勢乳酸菌92株，分為乳桿菌屬（Lactobacillus）和片球菌屬（Pediococcus），其中又包括了4個(gè)種：植物乳桿菌（Lactobucillus plantarum）13株，乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）50株

8、，短乳桿菌（Lactobacillus brevis）28株，副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）1株。通過對92株優(yōu)勢乳酸菌進(jìn)行產(chǎn)酸能力和耐低溫能力的篩選得到6株表現(xiàn)突出的乳酸菌，分別是短乳桿菌（LB-40、LB-59）、乳酸片球菌（PA-60、PA-69、PA-87）和植物乳桿菌（LP-66），其中LP-66在10和15℃條件下顯著降低了綠汁發(fā)酵液的pH值（P<0.05）；PA-87和LP-66在15、25

9、℃條件下長勢最好。就糖發(fā)酵能力來說，PA-87與實(shí)驗(yàn)室分離菌及標(biāo)準(zhǔn)菌相比有較強(qiáng)的糖源利用能力；就不同環(huán)境乳酸菌的生長能力來說，所有乳酸菌的生長溫度范圍都在10-50℃之間，所有乳酸菌的生長pH范圍都在3.5-9.0之間。但是青藏高原分離乳酸菌與購買的標(biāo)準(zhǔn)菌在具體的生長情況中存在明顯的差異。
　　5.將篩選得到的一株植物乳桿菌LP-66與購自美國的植物乳桿菌（ALP）同時(shí)作為青貯添加劑添加到垂穗披堿草青貯30天后發(fā)現(xiàn)：10℃條件下L

10、P-66組的乳酸含量顯著高于對照組及ALP處理組，在15℃條件下LP-66組比ALP處理組保存了更多的粗蛋白，同時(shí)ADF和NDF含量也顯著低于ALP處理組；對青貯60天的樣品進(jìn)行品質(zhì)測定發(fā)現(xiàn)：在10℃和25℃條件下LP-66處理組的pH值顯著低于對照組及ALP處理組；在25℃條件下LP-66處理組未檢測到酵母菌和霉菌。綜上結(jié)果可以初步斷定，相對于商品菌株，本研究分離篩選的植物乳桿菌在LP-66在低溫條件下表現(xiàn)出了一定的發(fā)酵優(yōu)勢，可作為在