肺移植瘤裸鼠透明質(zhì)酸的瘤學(xué)分布及特異結(jié)合蛋白(p-CLP)的示蹤學(xué)研究.pdf

1、研究目的：在研究人的腫瘤、肝病、眼科病、骨骼病等疾病的過程中，發(fā)現(xiàn)血液中透明質(zhì)酸（HA）的含量高于正常值。HA主要分布在細(xì)胞間質(zhì)中，這些HA均以復(fù)合物的形式以共價(jià)鍵與軟骨鏈蛋白（CLP）結(jié)合。一定濃度的鹽酸胍可以使CLP與HA解離，目前沒有人報(bào)道過豬軟骨鏈蛋白（p-CLP）體內(nèi)分布和代謝過程。為此，我們對(duì)以下內(nèi)容進(jìn)行初步探討：①p-CLP的分離提?。虎趐-CLP與HA體外結(jié)合特征；③肺移植瘤裸鼠HA的瘤學(xué)分布；④p-CLP在肺移植瘤裸鼠

2、中的組織分布。希望通過以上研究，獲得p-CLP的生物學(xué)和實(shí)驗(yàn)核醫(yī)學(xué)顯像研究基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為肺腫瘤成像和其它一些疾病的早期診斷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 研究方法：
　　 1.肺腺癌動(dòng)物模型與HA的瘤學(xué)分布 A549肺腺癌細(xì)胞接種BALB/C-nunu荷瘤裸鼠，分別飼養(yǎng)3、4、5、6周，免疫組化SP法測(cè)定HA在不同周齡的肺移植瘤裸鼠中的瘤內(nèi)分布。
　　 2.P-CLP的分離、純化、鑒定利用親和層析從豬肋軟骨分離純化p-CLP

3、，通過環(huán)氧氯丙烷活化Sepharose4B、HA-AH-Sepharose4B親和層析柱的制備，p-CLP粗制品勻漿、酶解、透析、濃縮、過柱、純化制成p-CLP；然后SDS-PAGE凝膠電泳分析p-CLP的分子量；p-CLP氨基酸分析確定p-CLP中氨基酸的含量；體外放射競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析測(cè)定p-CLP與HA的親和特性。
　　 3．P-CLP的碘標(biāo)記及示蹤分析 Na125I氯胺-T 氧化法標(biāo)記p-CLP，摸索最佳反應(yīng)條件，制備高比活度

4、的放射性探針；示蹤分布實(shí)驗(yàn)通過給肺移植瘤裸鼠尾靜脈注射125I-p-CLP，分別在5min、20min、30min、45min、1h、1.5h、3h、5h、7h時(shí)間段處死裸鼠，取血及重要臟器測(cè)量放射性，獲得p-CLP在裸鼠體內(nèi)的代謝和分布參數(shù)。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.HA免疫染色的陽性率為93％，免疫組化3-6周陽性組織光密度值分別為150.78±10.25、160.13±8.54、176.83±13.46、185

5、.95±13.61，對(duì)照組為37.43±5.17。T檢驗(yàn)顯示各組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。免疫組化法發(fā)現(xiàn)接種3-6周裸鼠隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)，HA表達(dá)逐漸增強(qiáng)，HA主要分布于腫瘤細(xì)胞周邊間質(zhì)，腫瘤組織HA表達(dá)豐富，而正常組織表達(dá)微弱。
　　 2．親和層析法提取p-CLP，紫外掃描為單一峰，抽提蛋白得率為2.21％，SDS-PAGE電泳顯示p-CLP有兩條條帶，分別為（44.36±2.90）KD和（71.58±4.13）KD；p

6、-CLP氨基酸分析顯示谷氨酸含量最高（2.26mg/20mg），酪氨酸含量為0.91mg/20mg；體外放射競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析實(shí)驗(yàn)顯示p-CLP與HA的親和力常數(shù)Ka為（6.30±1.73）×109M-1。
　　 3．P-CLP標(biāo)記顯示當(dāng)125I活度為0.925MBq、1.85MBq、3.7MBq、7.4MBq各組間標(biāo)記率有顯著性差異(均P<0.05)，7.4MBq、11.1MBq、14.8MBq組間標(biāo)記率無差異(均P>0.05)；當(dāng)

7、氯胺-T濃度為0.312mg/ml、0.625mg/ml時(shí)與其他各組間標(biāo)記率有差異(均P<0.05)，其他各組間標(biāo)記率無差異(均P>0.05)；在30s-8min的標(biāo)記時(shí)間中對(duì)標(biāo)記率影響不大，各組均無差異(均P>0.05)；125I活度、氯胺-T濃度、標(biāo)記時(shí)間對(duì)放射化學(xué)純度影響不大，各組無顯著性差異(均P>0.05)；氯胺-T濃度為0.625mg/ml和標(biāo)記時(shí)間為1min時(shí)125I-p-CLP生物結(jié)合活性最高；p-CLP示蹤分布實(shí)驗(yàn)表明

8、，p-CLP濃度在體內(nèi)20min時(shí)達(dá)到峰值，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，p-CLP在腫瘤內(nèi)的分布百分比逐漸升高。
　　 結(jié)論：
　　 1.HA在肺腫瘤組織中有增高的趨勢(shì)，其中在腫瘤細(xì)胞周邊間質(zhì)中有過多表達(dá)，隨著腫瘤生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，HA隨腫瘤細(xì)胞的增長(zhǎng)表達(dá)逐漸增強(qiáng)。
　　 2.P-CLP的最佳標(biāo)記條件為：125I 7.4MBq、1.25mg/ml氯胺-T 30μl、p-CLP 0.5mg，反應(yīng)體積100μl，反應(yīng)1min。