礦質(zhì)元素含量和氧化還原水平對(duì)棉花纖維伸長(zhǎng)調(diào)控的研究.pdf

1、棉花纖維細(xì)胞是自然界中最長(zhǎng)的單細(xì)胞之一。提高棉花纖維品質(zhì)能為紡織工業(yè)提供優(yōu)良的原材料。現(xiàn)在各種生物和非生物逆境因子（高溫、干旱、鹽堿、病蟲害、礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)缺乏及重金屬毒害等）對(duì)棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)造成的影響日趨嚴(yán)重。因此，研究逆境條件下纖維發(fā)育的生物學(xué)問題能為纖維品質(zhì)的改良提供新的方法和思路。本研究以胚珠培養(yǎng)體系為工具，結(jié)合轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究了礦質(zhì)元素缺乏及氧化脅迫等逆境因子對(duì)纖維品質(zhì)的影響。并通過一系列的研究闡述了Ca或者K缺乏誘導(dǎo)的信號(hào)與激素(

2、ABA、JA)和ROS相互作用調(diào)控纖維伸長(zhǎng)的分子機(jī)制。通過改變GhAPX1基因表達(dá)量來調(diào)節(jié)纖維細(xì)胞內(nèi)源H2O2和ASA含量的方法，探討細(xì)胞內(nèi)H2O2含量與纖維細(xì)胞伸長(zhǎng)之間的關(guān)系，詳細(xì)論述了ASA與ABA調(diào)控缺鐵條件下纖維發(fā)育的作用機(jī)制。具體結(jié)果如下:
　　1.胚珠培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)低鈣和低鉀共同作用促進(jìn)纖維伸長(zhǎng)
　　通過胚珠培養(yǎng)系統(tǒng)研究了11種礦質(zhì)元素含量變化(K、Ca、Mg、P、Fe、Mn、Zn、B、Cu、 Mo和Co)對(duì)棉花胚珠和

3、纖維發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中礦質(zhì)元素含量對(duì)纖維發(fā)育的作用存在一個(gè)最適宜的濃度。缺鈣能夠促進(jìn)纖維早期的伸長(zhǎng)并誘導(dǎo)纖維的褐化（培養(yǎng)2天后），低鉀(2mM或者27 mM)能顯著抑制纖維的伸長(zhǎng)。但當(dāng)培養(yǎng)基中低鉀和缺鈣同時(shí)發(fā)生時(shí)，纖維長(zhǎng)度比對(duì)照（低鉀和鈣正常）更長(zhǎng)并且纖維褐化顯著向后推遲（8天以后）。通過RNA-seq和離子組含量的分析，發(fā)現(xiàn)缺鈣誘導(dǎo)了XTH/PME等基因的上調(diào)表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞壁松弛，同時(shí)激活CIPK6基因的表達(dá)促進(jìn)了K離子吸收，促進(jìn)

4、了纖維伸長(zhǎng)。但是鈣缺乏誘導(dǎo)了胚珠和纖維中大量ROS的累積、JA含量的下降以及ABA的完全缺失，致使胚珠和纖褐化。低鉀(2mM或者27 mM)能夠通過上調(diào)抗氧化基因的表達(dá)以及提高JA和ABA的含量來抑制褐化。低鈣誘導(dǎo)的細(xì)胞伸長(zhǎng)與低鉀誘導(dǎo)的信號(hào)互補(bǔ)，共同作用促進(jìn)了纖維的伸長(zhǎng)。
　　2.H2O2是纖維伸長(zhǎng)的重要調(diào)控因子
　　礦質(zhì)元素的缺乏誘導(dǎo)ROS的累積，誘導(dǎo)組織的褐化并抑制纖維的伸長(zhǎng)。H2O2的含量在纖維發(fā)育轉(zhuǎn)換期(15 DPA

5、)有一個(gè)小高峰。在胚珠培養(yǎng)中施加不同濃度的H2O2和ROS生成的抑制劑DPI能夠改變纖維的發(fā)育進(jìn)程，這些結(jié)果說明H2O2能夠調(diào)控纖維伸長(zhǎng)的過程。為進(jìn)一步研究纖維中內(nèi)源H2O2的含量與纖維長(zhǎng)度之間的關(guān)系，對(duì)棉花纖維伸長(zhǎng)期(5-10 DPA)優(yōu)勢(shì)表達(dá)的基因GhAPX1AT/DT的表達(dá)量進(jìn)行了調(diào)控。構(gòu)建了該基因CaMV35S超量表達(dá)和特異干涉以及細(xì)胞質(zhì)APX家族干涉的三種載體，并成功轉(zhuǎn)化陸地棉。通過對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花材料纖維品質(zhì)多年多點(diǎn)的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)

6、35S超量表達(dá)棉花(OA)和GhAPX1AT/DT特異干涉(IAU)棉花纖維品質(zhì)變化不大，只有細(xì)胞質(zhì)類型APX干涉(IAO)類型的兩個(gè)棉花株系纖維長(zhǎng)度(26.06±0.31 mm和25.71±0.63 mm)相比陰性對(duì)照(28.42±0.67 mm)顯著降低，下降幅度達(dá)8.30％-9.54％。并且纖維整齊度指數(shù)，伸長(zhǎng)率，成熟度和短纖維指數(shù)也都相對(duì)于對(duì)照下降，纖維品質(zhì)變差。主要原因是H2O2在細(xì)胞質(zhì)APX干涉系中大量累積，抑制了纖維的伸長(zhǎng)

7、，特別是10 DPA纖維中H2O2含量增加了3.5倍。通過RNA-seq技術(shù)，在細(xì)胞質(zhì)APX干涉系10 DPA纖維中篩選到126個(gè)差異表達(dá)基因(DEGs)。其中在IAO株系上調(diào)表達(dá)的基因大部分在纖維次生壁時(shí)期優(yōu)勢(shì)表達(dá)，并且參與到氧化還原穩(wěn)態(tài)，脅迫響應(yīng)和次生壁合成等過程。因此，細(xì)胞質(zhì)APX基因是纖維細(xì)胞伸長(zhǎng)期氧化還原穩(wěn)態(tài)維持的關(guān)鍵基因，抑制細(xì)胞質(zhì)APX基因表達(dá)會(huì)導(dǎo)致H2O2含量的大量累積，誘發(fā)氧化脅迫，刺激次生壁基因在伸長(zhǎng)期的提前表達(dá)，從

8、而抑制了纖維的伸長(zhǎng)。
　　3.降低細(xì)胞質(zhì)APX的表達(dá)量能提高棉花缺鐵的耐受性
　　超量表達(dá)GhAPX1能夠增加纖維對(duì)高溫(37℃)和氧化脅迫(1mM H2O2)的耐受性，細(xì)胞質(zhì)APX干涉株系纖維對(duì)高溫和氧化脅迫更加敏感。但是，細(xì)胞質(zhì)APX干涉株系表現(xiàn)出對(duì)缺鐵更不敏感的表型。胚珠培養(yǎng)中缺鐵能夠抑制胚珠和纖維的發(fā)育，并在培養(yǎng)10天后誘導(dǎo)組織的褐化。缺鐵誘導(dǎo)的褐化在細(xì)胞質(zhì)APX干涉系胚珠和纖維出現(xiàn)的時(shí)間明顯向后推遲，并且胚珠沒有受

9、到缺鐵的抑制，F(xiàn)CR活性相比于正常條件顯著上升，同時(shí)細(xì)胞質(zhì)APX干涉系幼苗葉片在缺鐵處理兩周后沒有出現(xiàn)嚴(yán)重的黃化，這些結(jié)果表明細(xì)胞質(zhì)APX表達(dá)的下調(diào)提高了棉花缺鐵耐受性。
　　進(jìn)一步分析表明細(xì)胞質(zhì)APX干涉系缺鐵的耐受性的提高依賴于ASA含量的顯著上升。首先，RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)ASA合成和代謝途徑的基因都受到了缺鐵的調(diào)節(jié)，ASA含量上升。其次，ASA增加的幅度在缺鐵處理的細(xì)胞質(zhì)APX干涉系中顯著高于對(duì)照和超表達(dá)系。再次，外源施

10、加ASA能夠抑制缺鐵誘導(dǎo)的褐化，恢復(fù)胚珠的鮮重及高鐵還原活性，而外源施加H2O2卻不能達(dá)到上述效果。
　　4.ABA能提高棉花對(duì)缺鐵的耐受性
　　ASA一方面通過激活鐵吸收相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)增加耐受性，另一方面通過維持ABA的含量來降低缺鐵對(duì)胚珠和纖維造成的損害。在缺鐵處理6-10天后，胚珠和纖維中ABA的含量顯著下降，ABA含量下降的速度和比例在細(xì)胞質(zhì)APX干涉系中遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對(duì)照和超表達(dá)株系。對(duì)ABA合成和降解相關(guān)基因的檢測(cè)

11、發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)APX株系缺鐵條件處理10天后，ABA合成相關(guān)基因的表達(dá)沒有受到抑制;并且ABA降解相關(guān)基因的表達(dá)受缺鐵誘導(dǎo)上調(diào)的幅度顯著低于對(duì)照和超表達(dá)株系。外源施加10μM濃度的ABA能夠抑制缺鐵誘導(dǎo)的纖維的褐化并能夠恢復(fù)缺鐵抑制的高鐵還原活性，說明ABA能胚珠和纖維缺鐵的癥狀。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)，超表達(dá)ABA降解相關(guān)基因GhABAH1（脫落酸8'羥化酶）后棉花ABA的含量顯著下降，胚珠和纖維對(duì)缺鐵更加敏感，褐化表型早于對(duì)照出現(xiàn)。以上結(jié)果表