不同細(xì)胞生長因子在皮瓣壞死創(chuàng)面愈合中作用和機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　皮瓣手術(shù)是整形重建和口腔頜面部手術(shù)中最重要的技術(shù)之一。然而，無論是在實(shí)驗(yàn)還是臨床中，外科皮瓣壞死都是很難完全預(yù)防和避免的。皮瓣壞死往往導(dǎo)致皮瓣摘除。很多的研究都嘗試通過藥物，提高皮瓣成活率。然而，在這些研究中也有明顯的一些不足。許多研究中沒有動(dòng)物模型解剖學(xué)證據(jù);當(dāng)壞死即將發(fā)生時(shí)，沒有很好的解決方法;雖然一直對(duì)壞死的預(yù)防性研究很多，但關(guān)于促進(jìn)壞死修復(fù)的研究很少，對(duì)皮瓣壞死創(chuàng)口治療的研究更為鮮見。
　　KGF、EGF

2、和VEGF是生長因子領(lǐng)域研究最多的幾個(gè)生長因子，大量的文獻(xiàn)都確定其分別特異性對(duì)上皮細(xì)胞、主要對(duì)上皮細(xì)胞、特異性對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞有很強(qiáng)的生長促進(jìn)作用。KGF對(duì)上皮細(xì)胞的特異性作用，使其能促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖的同時(shí)，不促進(jìn)纖維生長，不導(dǎo)致疤痕形成，成為促進(jìn)上皮創(chuàng)口愈合最好的候選。EGF是臨床上應(yīng)用最多的生長因子之一，其對(duì)上皮的促進(jìn)作用得到很多患者及醫(yī)生的認(rèn)同。VEGF是迄今為止發(fā)現(xiàn)的促進(jìn)血管新生最有效的生長因子，能夠極大地提高外科皮瓣的成活，預(yù)防

3、皮瓣壞死。
　　皮瓣壞死的基因預(yù)防及治療是一種極有潛力的方法，是未來研究的發(fā)展方向。當(dāng)今皮瓣的基因研究主要是以生長因子作為治療性基因完成的。如何以最佳的方法將外源性DNA導(dǎo)入皮瓣，使細(xì)胞接收并表達(dá)外源DNA，一直是值得大家研究和探討的問題。
　　我們以腺病毒為載體(Ad)，攜帶角化細(xì)胞生長因子(KGF)基因的方法，利用復(fù)制缺陷型腺病毒載體重組KGF基因，通過其強(qiáng)感染能力與轉(zhuǎn)基因能力，在體外體內(nèi)特異性表達(dá)有活性的KGF蛋白，發(fā)

4、揮定向修復(fù)組織損傷的作用。另外我們直接在大鼠背部的壞死皮瓣區(qū)域中和皮膚中注入EGF和VEGF，觀察聯(lián)合應(yīng)用生長因子是否會(huì)對(duì)皮瓣區(qū)壞死愈合起作用。
　　方法：
　　1.PacⅠ核酸內(nèi)切酶酶切鑒定腺病毒質(zhì)粒，測序檢測是否質(zhì)粒存在變異。PacⅠ核酸內(nèi)切酶酶切pAd-KGF，線性化后的pAd-KGF轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293(293)細(xì)胞后，制備Ad-KGF。應(yīng)用293細(xì)胞擴(kuò)增、純化得到Ad-KGF病毒。應(yīng)用于后續(xù)細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，并觀察病毒

5、轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后，細(xì)胞形態(tài)及病毒的感染能力。
　　2.Ad-KGF感染正常細(xì)胞系PA317，HUVEC，HaCaT，和293細(xì)胞后，觀察病毒的感染的能力;提取受感染細(xì)胞的RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA后，進(jìn)行半定量PCR和熒光定量PCR，檢測細(xì)胞內(nèi)KGF的表達(dá)水平;通過ELISA，檢測受感染細(xì)胞上清中KGF的表達(dá)水平;通過劃痕實(shí)驗(yàn)?zāi)７聜冢囵B(yǎng)HaCaT細(xì)胞48小時(shí)，確定KGF對(duì)上皮細(xì)胞生長遷移的作用;將PA317細(xì)胞，HUVEC細(xì)胞

6、和HaCaT細(xì)胞接種于Transwell小室，293細(xì)胞+Ad-KGF轉(zhuǎn)染24小時(shí)(293+Ad-KGF)，293細(xì)胞+ Ad轉(zhuǎn)染24小時(shí)(293+Ad)，HaCaT，293細(xì)胞和293細(xì)胞+KGF(293+KGF)接種于下室內(nèi)，觀察KGF和Ad-KGF對(duì)成纖維細(xì)胞系，血管內(nèi)皮細(xì)胞系和上皮細(xì)胞系的生長遷移作用。
　　3.我們首先解剖大鼠背部，研究確定大鼠背部血管走行。在傳統(tǒng)大鼠背部皮瓣模型上，改良手術(shù)及實(shí)驗(yàn)過程，使皮瓣發(fā)生壞死。記

7、錄大鼠的體重，皮瓣壞死面積和愈合情況。在術(shù)后第15天，25天，和45天過量水合氯醛處死大鼠，取背部壞死皮瓣標(biāo)本，進(jìn)行組織化學(xué)染色分析。
　　4.在建立大鼠背部皮瓣模型之后，所有動(dòng)物分為四組。將1 ml PBS+dexamethasone(DXM),1 ml PBS+Ad-KGF+DXM, or1 ml PBS+Ad+DXM分別注入大鼠背部皮瓣壞死區(qū)皮下和創(chuàng)口邊緣，分別于術(shù)后5天，10天，20天，和30天注射相同的藥物。隔日記錄體重

8、，直至創(chuàng)面壞死愈合。術(shù)后第15天，25天，和35天過量水合氯醛處死大鼠，取背部壞死皮瓣標(biāo)本，進(jìn)行組織化學(xué)Masson染色、免疫組化染色分析和熒光定量PCR分析，上皮及上皮下組織的生長情況，上皮的生長厚度，取血清進(jìn)行ELISA檢測KGF表達(dá)水平。
　　5.首先通過細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)確定EGF和VEGF對(duì)PA317，HUVEC，和HaCaT細(xì)胞遷移的活性。建立大鼠背部皮瓣模型，壞死發(fā)生后，沿創(chuàng)口邊緣及壞死皮下注入1 ml PBS+EGF(1

9、50 mg/kg),1 ml PBS+VEGF(10μg), or1 ml PBS+EGF(150μg/kg)+VEGF(10μg)。隔日記錄體重并注射相同的藥物，直至創(chuàng)面壞死愈合。術(shù)后第15天和25天過量水合氯醛處死大鼠，取背部壞死皮瓣標(biāo)本，進(jìn)行組織化學(xué)Masson染色和免疫組化染色分析創(chuàng)緣上皮及上皮下組織的生長情況，上皮的生長厚度，并取血清進(jìn)行ELISA檢測。
　　結(jié)果：
　　1.酶切鑒定結(jié)果與設(shè)計(jì)和文獻(xiàn)相符，證明載體p

10、Ad-KGF構(gòu)建正確。pAd-KGF質(zhì)粒測序結(jié)果顯示起始位點(diǎn):第185bp，ATG。終結(jié)位點(diǎn):第679bp，TAA。全序列對(duì)比小鼠KGF基因序列，二者完全匹配，不存在突變。病毒轉(zhuǎn)染正常293細(xì)胞24小時(shí)，開始出現(xiàn)細(xì)胞變圓;熒光顯微鏡鏡下觀察，部分293細(xì)胞開始表達(dá)大量熒光蛋白。轉(zhuǎn)染第96小時(shí)后，所有293產(chǎn)生細(xì)胞病理效應(yīng)，顯微鏡下觀察所有細(xì)胞呈圓球形葡萄樣改變，漂浮于培養(yǎng)液中，熒光顯微鏡鏡下觀察293細(xì)胞呈圓球形，表達(dá)大量熒光蛋白。重組

11、腺病毒Ad-KGF和Ad在293細(xì)胞內(nèi)大量擴(kuò)增，并收集后。測得Ad-KGF病毒的效價(jià)滴度為2×1011PFU/ml， Ad病毒的效價(jià)滴度為3×1012PFU/ml。
　　2.pAd-KGF為構(gòu)建腺病毒質(zhì)粒。半定量PCR證明pAd-KG內(nèi)存在KGF表達(dá)基因。經(jīng)過基因重組后的腺病毒Ad-KGF具有感染正常細(xì)胞，于正常細(xì)胞內(nèi)表達(dá)KGF的能力。正常的293細(xì)胞不能表達(dá)KGF的mRNA，PA317細(xì)胞能分泌KGF，表達(dá)KGF mRNA。Ad

12、-KGF感染293細(xì)胞后，細(xì)胞成功表達(dá)KGF mRNA，而在293細(xì)胞和293+空病毒Ad內(nèi)不能表達(dá)KGF mRNA。通過ELISA檢測培養(yǎng)液上清中外分泌的KGF含量。檢測證明Ad空病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后48小時(shí)，上清液中不分泌KGF蛋白，而Ad-KGF轉(zhuǎn)染細(xì)胞的后的48小時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)上清中能夠檢測到大量的KGF表達(dá)，且濃度隨著Ad-KGF的滴度增加而增加。通過劃痕實(shí)驗(yàn)，證明在KGF作用下，HaCaT上皮細(xì)胞的遷移能力顯著增加。而對(duì)照組細(xì)胞開始

13、出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)證明KGF能有效促進(jìn)HaCaT上皮細(xì)胞生長遷移，而對(duì)HUVEC血管內(nèi)皮細(xì)胞作用不明顯，對(duì)PA317成纖維細(xì)胞沒有明顯作用。
　　3.大鼠背部七條靜脈和一側(cè)有超過二十條動(dòng)脈分布。手術(shù)后三天，大鼠的體重會(huì)稍有下降，然后穩(wěn)定上升。PBS組和空白組中壞死面積在9天內(nèi)達(dá)到最高峰。從9至47天中，壞死面積逐漸減少，在47天壞死幾乎完全愈合。組織病理檢查中，可見術(shù)后15天，壞死創(chuàng)口邊緣上皮細(xì)胞增生明顯

14、，有少量纖維成分生成，創(chuàng)口愈合區(qū)有大量小脈管形成和大量不成熟的纖維成分形成。至第35天，上皮增生修復(fù)較前明顯弱，但較正常上皮，厚度仍明顯增大。
　　4.成功建立大鼠背部皮瓣壞死模型后，四組動(dòng)物術(shù)后體重均有輕度下降，從第三天開始，體重逐步上升，其中以DXM組的體重上升最明顯。術(shù)后第五天，壞死成活區(qū)域分界清晰。術(shù)后第十天，壞死面積達(dá)到最大。隨著不同藥物的治療，壞死面積在各組間都明顯下降，且Ad-KGF組壞死面積縮小最為明顯。Masso

15、n染色顯示術(shù)后15天，四組壞死創(chuàng)口邊緣上皮都明顯增生，其中Ad-KGF組上皮細(xì)胞增生最多。術(shù)后35天，Ad-KGF組壞死傷口已經(jīng)愈合，而其它三組還有較大的壞死面積。術(shù)后15天和25天，上皮細(xì)胞厚度在Ad-KGF組增生最為明顯，術(shù)后35天上皮厚度與其它組間沒有大的差異。
　　免疫組織化學(xué)分析顯示，只有在Ad-KGF組的上皮和間充質(zhì)細(xì)胞中有強(qiáng)陽性的KGF表達(dá)，而其它三組均為陰性。Anti-CD34免疫組織化學(xué)染色顯示四組的小血管生成數(shù)

16、目相當(dāng)
　　5.PA317在EGF, VEGF，VEGF+EGF,或PA317作用下，沒有顯著性的生長差異。HUVEC對(duì)VEGF表現(xiàn)出明顯生長加速，在EGF和VEGF聯(lián)合作用下，生長更加明顯，而與PA317共培養(yǎng)時(shí)，也有少量生長改變。HaCaT細(xì)胞在EGF和VEGF+EGF聯(lián)合作用下都是表現(xiàn)出生長遷移能力提高。建立動(dòng)物模型后，分組如下:PBS，EGF, VEGF, EGF+VEGF。四組動(dòng)物術(shù)后體重均有輕度下降，從第三天開始，體重

17、逐步上升，其中以EGF組的體重上升最少。隨著不同藥物的治療，壞死面積在各組間都明顯下降，且VEGF+EGF組壞死面積縮小最為明顯。
　　術(shù)后15天和25天，Anti-CD34免疫組織化學(xué)染色顯示EGF, VEGF和VEGF+EGF組的小微血管生成數(shù)目相當(dāng)，都顯著高于PBS組。
　　結(jié)論：
　　1.pAd-KGF經(jīng)過酶切鑒定和測序鑒定具有KGF完全匹配的基因組。成功構(gòu)建Ad-KGF和Ad，且具有感染細(xì)胞的能力。Ad-KG

18、F和Ad經(jīng)過擴(kuò)增純化的滴度為2×1011PFU/ml和3×1012PFU/ml，可以滿足細(xì)胞及大鼠皮瓣實(shí)驗(yàn)的要求。
　　2.Ad-KGF和Ad可以高效轉(zhuǎn)染PA317、HUVEC和HaCaT細(xì)胞，并在轉(zhuǎn)染后高效表達(dá)活性KGF。KGF可有效促進(jìn)HaCaT細(xì)胞生長，而對(duì)PA317、HUVEC細(xì)胞作用不明顯。
　　3.本實(shí)驗(yàn)在確定大鼠背部血供系統(tǒng)基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)形成一套簡便且易于推廣的手術(shù)和皮瓣壞死模型流程，成功建立了穩(wěn)定的大鼠背部皮瓣