不同細胞生長因子在皮瓣壞死創(chuàng)面愈合中作用和機制研究.pdf

1、背景：
　　皮瓣手術是整形重建和口腔頜面部手術中最重要的技術之一。然而，無論是在實驗還是臨床中，外科皮瓣壞死都是很難完全預防和避免的。皮瓣壞死往往導致皮瓣摘除。很多的研究都嘗試通過藥物，提高皮瓣成活率。然而，在這些研究中也有明顯的一些不足。許多研究中沒有動物模型解剖學證據(jù);當壞死即將發(fā)生時，沒有很好的解決方法;雖然一直對壞死的預防性研究很多，但關于促進壞死修復的研究很少，對皮瓣壞死創(chuàng)口治療的研究更為鮮見。
　　KGF、EGF

2、和VEGF是生長因子領域研究最多的幾個生長因子，大量的文獻都確定其分別特異性對上皮細胞、主要對上皮細胞、特異性對血管內皮細胞有很強的生長促進作用。KGF對上皮細胞的特異性作用，使其能促進上皮細胞增殖的同時，不促進纖維生長，不導致疤痕形成，成為促進上皮創(chuàng)口愈合最好的候選。EGF是臨床上應用最多的生長因子之一，其對上皮的促進作用得到很多患者及醫(yī)生的認同。VEGF是迄今為止發(fā)現(xiàn)的促進血管新生最有效的生長因子，能夠極大地提高外科皮瓣的成活，預防

3、皮瓣壞死。
　　皮瓣壞死的基因預防及治療是一種極有潛力的方法，是未來研究的發(fā)展方向。當今皮瓣的基因研究主要是以生長因子作為治療性基因完成的。如何以最佳的方法將外源性DNA導入皮瓣，使細胞接收并表達外源DNA，一直是值得大家研究和探討的問題。
　　我們以腺病毒為載體(Ad)，攜帶角化細胞生長因子(KGF)基因的方法，利用復制缺陷型腺病毒載體重組KGF基因，通過其強感染能力與轉基因能力，在體外體內特異性表達有活性的KGF蛋白，發(fā)

4、揮定向修復組織損傷的作用。另外我們直接在大鼠背部的壞死皮瓣區(qū)域中和皮膚中注入EGF和VEGF，觀察聯(lián)合應用生長因子是否會對皮瓣區(qū)壞死愈合起作用。
　　方法：
　　1.PacⅠ核酸內切酶酶切鑒定腺病毒質粒，測序檢測是否質粒存在變異。PacⅠ核酸內切酶酶切pAd-KGF，線性化后的pAd-KGF轉染進HEK293(293)細胞后，制備Ad-KGF。應用293細胞擴增、純化得到Ad-KGF病毒。應用于后續(xù)細胞及動物實驗，并觀察病毒

5、轉染293細胞后，細胞形態(tài)及病毒的感染能力。
　　2.Ad-KGF感染正常細胞系PA317，HUVEC，HaCaT，和293細胞后，觀察病毒的感染的能力;提取受感染細胞的RNA，逆轉錄得到cDNA后，進行半定量PCR和熒光定量PCR，檢測細胞內KGF的表達水平;通過ELISA，檢測受感染細胞上清中KGF的表達水平;通過劃痕實驗模仿傷口，培養(yǎng)HaCaT細胞48小時，確定KGF對上皮細胞生長遷移的作用;將PA317細胞，HUVEC細胞

6、和HaCaT細胞接種于Transwell小室，293細胞+Ad-KGF轉染24小時(293+Ad-KGF)，293細胞+ Ad轉染24小時(293+Ad)，HaCaT，293細胞和293細胞+KGF(293+KGF)接種于下室內，觀察KGF和Ad-KGF對成纖維細胞系，血管內皮細胞系和上皮細胞系的生長遷移作用。
　　3.我們首先解剖大鼠背部，研究確定大鼠背部血管走行。在傳統(tǒng)大鼠背部皮瓣模型上，改良手術及實驗過程，使皮瓣發(fā)生壞死。記

7、錄大鼠的體重，皮瓣壞死面積和愈合情況。在術后第15天，25天，和45天過量水合氯醛處死大鼠，取背部壞死皮瓣標本，進行組織化學染色分析。
　　4.在建立大鼠背部皮瓣模型之后，所有動物分為四組。將1 ml PBS+dexamethasone(DXM),1 ml PBS+Ad-KGF+DXM, or1 ml PBS+Ad+DXM分別注入大鼠背部皮瓣壞死區(qū)皮下和創(chuàng)口邊緣，分別于術后5天，10天，20天，和30天注射相同的藥物。隔日記錄體重

8、，直至創(chuàng)面壞死愈合。術后第15天，25天，和35天過量水合氯醛處死大鼠，取背部壞死皮瓣標本，進行組織化學Masson染色、免疫組化染色分析和熒光定量PCR分析，上皮及上皮下組織的生長情況，上皮的生長厚度，取血清進行ELISA檢測KGF表達水平。
　　5.首先通過細胞遷移實驗確定EGF和VEGF對PA317，HUVEC，和HaCaT細胞遷移的活性。建立大鼠背部皮瓣模型，壞死發(fā)生后，沿創(chuàng)口邊緣及壞死皮下注入1 ml PBS+EGF(1

9、50 mg/kg),1 ml PBS+VEGF(10μg), or1 ml PBS+EGF(150μg/kg)+VEGF(10μg)。隔日記錄體重并注射相同的藥物，直至創(chuàng)面壞死愈合。術后第15天和25天過量水合氯醛處死大鼠，取背部壞死皮瓣標本，進行組織化學Masson染色和免疫組化染色分析創(chuàng)緣上皮及上皮下組織的生長情況，上皮的生長厚度，并取血清進行ELISA檢測。
　　結果：
　　1.酶切鑒定結果與設計和文獻相符，證明載體p

10、Ad-KGF構建正確。pAd-KGF質粒測序結果顯示起始位點:第185bp，ATG。終結位點:第679bp，TAA。全序列對比小鼠KGF基因序列，二者完全匹配，不存在突變。病毒轉染正常293細胞24小時，開始出現(xiàn)細胞變圓;熒光顯微鏡鏡下觀察，部分293細胞開始表達大量熒光蛋白。轉染第96小時后，所有293產生細胞病理效應，顯微鏡下觀察所有細胞呈圓球形葡萄樣改變，漂浮于培養(yǎng)液中，熒光顯微鏡鏡下觀察293細胞呈圓球形，表達大量熒光蛋白。重組

11、腺病毒Ad-KGF和Ad在293細胞內大量擴增，并收集后。測得Ad-KGF病毒的效價滴度為2×1011PFU/ml， Ad病毒的效價滴度為3×1012PFU/ml。
　　2.pAd-KGF為構建腺病毒質粒。半定量PCR證明pAd-KG內存在KGF表達基因。經過基因重組后的腺病毒Ad-KGF具有感染正常細胞，于正常細胞內表達KGF的能力。正常的293細胞不能表達KGF的mRNA，PA317細胞能分泌KGF，表達KGF mRNA。Ad

12、-KGF感染293細胞后，細胞成功表達KGF mRNA，而在293細胞和293+空病毒Ad內不能表達KGF mRNA。通過ELISA檢測培養(yǎng)液上清中外分泌的KGF含量。檢測證明Ad空病毒轉染細胞后48小時，上清液中不分泌KGF蛋白，而Ad-KGF轉染細胞的后的48小時，細胞培養(yǎng)上清中能夠檢測到大量的KGF表達，且濃度隨著Ad-KGF的滴度增加而增加。通過劃痕實驗，證明在KGF作用下，HaCaT上皮細胞的遷移能力顯著增加。而對照組細胞開始

13、出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。Transwell細胞遷移實驗證明KGF能有效促進HaCaT上皮細胞生長遷移，而對HUVEC血管內皮細胞作用不明顯，對PA317成纖維細胞沒有明顯作用。
　　3.大鼠背部七條靜脈和一側有超過二十條動脈分布。手術后三天，大鼠的體重會稍有下降，然后穩(wěn)定上升。PBS組和空白組中壞死面積在9天內達到最高峰。從9至47天中，壞死面積逐漸減少，在47天壞死幾乎完全愈合。組織病理檢查中，可見術后15天，壞死創(chuàng)口邊緣上皮細胞增生明顯

14、，有少量纖維成分生成，創(chuàng)口愈合區(qū)有大量小脈管形成和大量不成熟的纖維成分形成。至第35天，上皮增生修復較前明顯弱，但較正常上皮，厚度仍明顯增大。
　　4.成功建立大鼠背部皮瓣壞死模型后，四組動物術后體重均有輕度下降，從第三天開始，體重逐步上升，其中以DXM組的體重上升最明顯。術后第五天，壞死成活區(qū)域分界清晰。術后第十天，壞死面積達到最大。隨著不同藥物的治療，壞死面積在各組間都明顯下降，且Ad-KGF組壞死面積縮小最為明顯。Masso

15、n染色顯示術后15天，四組壞死創(chuàng)口邊緣上皮都明顯增生，其中Ad-KGF組上皮細胞增生最多。術后35天，Ad-KGF組壞死傷口已經愈合，而其它三組還有較大的壞死面積。術后15天和25天，上皮細胞厚度在Ad-KGF組增生最為明顯，術后35天上皮厚度與其它組間沒有大的差異。
　　免疫組織化學分析顯示，只有在Ad-KGF組的上皮和間充質細胞中有強陽性的KGF表達，而其它三組均為陰性。Anti-CD34免疫組織化學染色顯示四組的小血管生成數(shù)

16、目相當
　　5.PA317在EGF, VEGF，VEGF+EGF,或PA317作用下，沒有顯著性的生長差異。HUVEC對VEGF表現(xiàn)出明顯生長加速，在EGF和VEGF聯(lián)合作用下，生長更加明顯，而與PA317共培養(yǎng)時，也有少量生長改變。HaCaT細胞在EGF和VEGF+EGF聯(lián)合作用下都是表現(xiàn)出生長遷移能力提高。建立動物模型后，分組如下:PBS，EGF, VEGF, EGF+VEGF。四組動物術后體重均有輕度下降，從第三天開始，體重

17、逐步上升，其中以EGF組的體重上升最少。隨著不同藥物的治療，壞死面積在各組間都明顯下降，且VEGF+EGF組壞死面積縮小最為明顯。
　　術后15天和25天，Anti-CD34免疫組織化學染色顯示EGF, VEGF和VEGF+EGF組的小微血管生成數(shù)目相當，都顯著高于PBS組。
　　結論：
　　1.pAd-KGF經過酶切鑒定和測序鑒定具有KGF完全匹配的基因組。成功構建Ad-KGF和Ad，且具有感染細胞的能力。Ad-KG

18、F和Ad經過擴增純化的滴度為2×1011PFU/ml和3×1012PFU/ml，可以滿足細胞及大鼠皮瓣實驗的要求。
　　2.Ad-KGF和Ad可以高效轉染PA317、HUVEC和HaCaT細胞，并在轉染后高效表達活性KGF。KGF可有效促進HaCaT細胞生長，而對PA317、HUVEC細胞作用不明顯。
　　3.本實驗在確定大鼠背部血供系統(tǒng)基礎上，設計形成一套簡便且易于推廣的手術和皮瓣壞死模型流程，成功建立了穩(wěn)定的大鼠背部皮瓣