糖尿病大鼠骨代謝特點(diǎn)的研究觀察.pdf

1、目的：采用高糖高脂肪飲食結(jié)合小劑量鏈脲佐菌素和單次大劑量鏈脲佐菌素的方法，用雄性Wistar大鼠制備2型和1型糖尿病模型，以正常血糖大鼠和病程匹配的自發(fā)性2型糖尿病模型GK大鼠分別作為陰性和陽性對照，測定離體骨密度(BMD)、骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)和生物力學(xué)等指標(biāo)、骨轉(zhuǎn)換血清生化標(biāo)志物及調(diào)節(jié)骨代謝的細(xì)胞因子，觀察糖尿病狀態(tài)下大鼠骨代謝的特點(diǎn)；并與大鼠胰島素水平及代謝控制等因素進(jìn)行相關(guān)分析，尋找導(dǎo)致其骨代謝紊亂的可能機(jī)制。 方法：實(shí)驗(yàn)動

2、物分為四組：正常對照組(NC組)、2型糖尿病組(T2D組)、1型糖尿病組(T1D組)和自發(fā)性2型糖尿病模型GK大鼠(GK組)。T2D組大鼠在給予高脂飲食8周后，空腹?fàn)顟B(tài)下一次性腹腔注射小劑量STZ(30mg/kg)，1周后空腹?fàn)顟B(tài)下行腹腔葡萄糖耐量試驗(yàn)，空腹血糖≥7.0mmol/L或2小時血糖≥11.1mmol/L確認(rèn)為造模成功。T1D組大鼠空腹?fàn)顟B(tài)下給予一次性腹腔注射大劑量STZ(60mg/kg)，72h后測隨機(jī)血糖≥16/7mmol

3、/L者，確定糖尿病模型建立。建模成功后繼續(xù)喂養(yǎng)20周，同時納入病程相近的GK大鼠作為陽性對照。所有動物在處死前第14天開始進(jìn)行四環(huán)素標(biāo)記。試驗(yàn)結(jié)束時，留取24小時尿檢測尿Ca、肌酐和羥脯氨酸，計(jì)算羥脯氨酸(HOP)排出率；所有大鼠禁食12小時后測空腹體重，麻醉狀態(tài)下取血樣測定空腹血糖、胰島素、糖化血紅蛋白(GHb)、Ca、P、腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素(IL)-1β、IL-6、胰島素樣生長因子(IGF)-1、骨鈣素(OCN)水平

4、和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)活性；留取腰椎、股骨、脛骨等骨標(biāo)本，測定第五腰椎及股骨BMD，做腰椎壓縮試驗(yàn)及股骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)，取右側(cè)脛骨上端以甲基丙烯酸甲酯包埋，制作不脫鈣骨切片。應(yīng)用多媒體病理圖像分析軟件對VonKossa染色的5μm切片和未染色的7μm切片進(jìn)行骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)分析。 結(jié)果：1、糖代謝狀態(tài)的檢測：T2D組空腹血糖、GHb、胰島素水平及HOMA-IR均明顯高于NC組(P＜0.01)，血清TG、TC和LDL水平也

5、明顯升高(P＜0.05或P＜0.01)。2、BMD和骨量的變化：T2D組、T1D組和GK組股骨、腰椎BMD和股骨灰干重比均明顯低于NC組(P＜0.05)；各指標(biāo)在糖尿病大鼠各組間無明顯差異(P＞0.05)。3、生物力學(xué)結(jié)果顯示：股骨三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)中T2D組、T1D組和GK組的最大載荷、能量吸收、最大應(yīng)變、截面慣性矩和彎曲剛性系數(shù)均明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)；T1D組生物力學(xué)指標(biāo)較T2D組更顯著(P＜0.05)，而GK大鼠股骨生

6、物力學(xué)指標(biāo)無明顯差異。腰椎壓縮試驗(yàn)中各組糖尿病大鼠的彈性模量和最大載荷均較對照組顯著降低(P＜0.01)；以TlD組的變化更明顯(P＜0.05或P＜0.01)，而GK大鼠各項(xiàng)生物力學(xué)指標(biāo)變化與T2D組大鼠相似(P＞0.05)。4、骨組織形態(tài)學(xué)結(jié)果：各組糖尿病大鼠骨體積顯著低于對照組(P＜0.01)，Tb.Th、OS/BS和O.Th均明顯降低(P＜0.01或P＜0.05)；TlD組和GK大鼠的破骨細(xì)胞標(biāo)記ES/BS也有明顯下降(P＜0.0

7、5)。各組糖尿病大鼠骨組織動力學(xué)參數(shù)MS/BS、骨礦化沉積率和BFR均明顯降低(P＜0.01)，T1D組和T2D組的類骨質(zhì)成熟時間Omt明顯延長(P＜0.05)；但骨礦化延遲時間Mlt沒有明顯變化。糖尿病大鼠各組間沒有明顯差異(P＞0.05)。5、血尿骨代謝指標(biāo)的變化：各組大鼠血鈣、磷水平無明顯差異(P＞0.05)。與NC組相比，各組糖尿病大鼠血清24h尿鈣、TRAP活性和羥脯氨酸排除率HOP/Cr顯著升高(P＜0.01)，血清OCN水

8、平明顯降低(P＜0.01)；同時，血清IGF-1水平明顯下降(P＜0.01)，且T1D大鼠IGF-1水平明顯低于T2D大鼠(P＜0.01)。6、血清炎性細(xì)胞因子：各組糖尿病大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平均明顯高于對照組(P＜0.01)，糖尿病大鼠各組間無明顯差異(P＞0.05)。7、相關(guān)分析：GHb與骨密度、骨生物力學(xué)指標(biāo)及BV/TV均顯著負(fù)相關(guān)，IL-1β、IL-6和TNF-α與骨密度也顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。

9、 結(jié)論：1、高糖高脂飲食和小劑量STZ誘導(dǎo)的Wistar大鼠呈現(xiàn)明顯的高血糖、高胰島素血癥和胰島素抵抗，并伴有血脂代謝紊亂，可用來成功制造2型糖尿病動物模型；2、該模型大鼠無明顯肥胖，可摒除肥胖對骨代謝的影響，可作為研究2型糖尿病骨代謝紊亂的理想動物模型。3、糖尿病狀態(tài)下大鼠表現(xiàn)為骨密度和骨量減少，骨力學(xué)強(qiáng)度降低；4、糖尿病狀態(tài)下大鼠不僅出現(xiàn)血、尿骨代謝標(biāo)記的異常，且可出現(xiàn)明顯的骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，成骨細(xì)胞功能障礙可能是糖尿病骨代謝失

10、衡的主要機(jī)制，但破骨細(xì)胞也可能參與其中。5、糖尿病大鼠骨密度、骨生物力學(xué)和骨形態(tài)學(xué)指標(biāo)與糖化血紅蛋白明顯負(fù)相關(guān)，提示高血糖及其糖基化終產(chǎn)物可能在糖尿病大鼠骨代謝紊亂中具有重要作用。 第二部分糖尿病大鼠骨組織RAGE、OPG、RANKL和IGF-1基因表達(dá)的研究 目的：采用單次注射大劑量鏈脲佐菌素的方法，用Wistar大鼠制備胰島素缺乏的糖尿病模型，免疫組化方法檢測骨組織中AGEs受體RAGE的表達(dá)，并用RT-PCR方法測

11、定骨組織RAGE、RANKL、OPG、IGF-1等基因表達(dá)，初步探討糖尿病狀態(tài)下高血糖和糖基化終產(chǎn)物對大鼠骨代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響。 方法：雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對照組(NC)、糖尿病組(T1D組)和糖尿病胰島素治療組(DI組)。T1D糖尿病的建模方法同前，成模后治療組給予胰島素0.6～1u/d以控制隨機(jī)血糖在10mmol/L以下，T1D組大鼠隔日皮下注射長效胰島素0.3～0.6u，以防止酮癥發(fā)生，但不明顯影響血糖水平

12、，隨機(jī)血糖在16mmol/l以上。糖尿病建模成功后繼續(xù)喂養(yǎng)20周處死。試驗(yàn)結(jié)束時，留取24小時尿檢測尿肌酐和羥脯氨酸，計(jì)算羥脯氨酸(HOP)排出率；麻醉狀態(tài)下取血樣測定空腹血糖、糖化血紅蛋白(GHb)、骨鈣素(OCN)水平和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)活性；留取股骨、脛骨等骨標(biāo)本，測定左側(cè)股骨BMD，用手術(shù)刀片刮除右側(cè)股骨骨膜后裝于凍存管中迅速投入液氮中，再轉(zhuǎn)入-70℃冰箱保存。脛骨經(jīng)甲基丙烯酸甲酯包埋，制作不脫鈣骨切片。采用免疫組化

13、方法檢測脛骨組織RAGE蛋白表達(dá)，應(yīng)用多媒體病理圖像分析軟件測定RAGE陽性細(xì)胞積分光密度值。提取大鼠骨組織的總mRNA，利用實(shí)時熒光定量RT-PCR方法檢測大鼠股骨RAGE、RANKL、OPG和IGF-1基因表達(dá)。 結(jié)果：1、與NC組相比，T1D組骨組織RAGE免疫組化平均光密度值明顯升高(P＜0.01)。RT-PCR顯示T1D組大鼠股骨IGF-1mRNA表達(dá)明顯下降(P＜0.01)，RAGE、RANKL，mRNA水平顯著升高

14、(P＜0.01或P＜0.05)，OPGmRNA水平無明顯變化(P＞0.05)，而OPG/RANKL比值明顯低于對照組(P＜0.01)。胰島素治療可顯著改善上述糖尿病大鼠的變化(P＜0.01)。2、相關(guān)分析分析顯示，糖尿病大鼠RAGE蛋白免疫組化染色平均光密度值和mRNA水平與糖化血紅蛋白水平顯著正相關(guān)(r=0.656，P＜0.01：r=0.535，P＜0.05)；RAGEmRNA與股骨BMD和血清骨鈣素水平均顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.583

15、，P＜0.01；r=-0.519，P＜0.05)，與血清TRAP和羥脯氨酸排泄率無明顯相關(guān)性。糖尿病大鼠骨組織RAGEmRNA與RANKLmRNA和RANKL/OPG比值均顯著正相關(guān)(r=0.555，P＜0.05；r=0.651，P＜0.01)；與IGF-1mRNA顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.459，P＜0.05)；與OPGmRNA沒有顯著相關(guān)性。IGF-1mRNA與RANKLmRNA和RANKL/OPG比值均顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.672，P

16、＜0.01；r=-0.567，P＜0.05)。 結(jié)論：1、高血糖狀態(tài)下累積的AGEs誘導(dǎo)其受體RAGEmRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)；2、糖尿病大鼠骨組織RAGE表達(dá)增加，可能通過上調(diào)RANKL表達(dá)作用于偶聯(lián)骨重建的OPG/RANKL/RANK軸，使破骨細(xì)胞活性增加，而成骨細(xì)胞功能受抑，參與糖尿病大鼠骨丟失的發(fā)生。3、RAGE表達(dá)上調(diào)可能與骨組織局部IGF-1表達(dá)降低有關(guān)，后者可直接或間接通過對OPG/RANKL/RANK軸的作用而影響