賴型鉤端螺旋體毒力相關(guān)基因ompl17的蛋白質(zhì)功能學研究.pdf

1、鉤端螺旋體病(簡稱鉤體病)是由鉤端螺旋體引起的一種人獸共患自然免疫源性疾病，它在世界范圍內(nèi)流行，并嚴重危害人類的健康和農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)。鉤端螺旋體(簡稱鉤體)在結(jié)構(gòu)和遺傳特征上都比較特殊，因而大多數(shù)細菌學研究方法不適于鉤體研究。隨著中國南方中心對賴型鉤體56601的測序完成，為鉤體病的研究提供了新的契機，但是與鉤體致病或毒力相關(guān)的因子研究報道還相對較少，致使鉤體致病的分子機制研究進展緩慢。因此，闡明鉤端螺旋體的致病機制是控制本病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

2、 本室曾以抑制消減雜交技術(shù)(Substration SlJppressiVeHybridization，SSH)篩選得到致病鉤體與非致病鉤體的差異基因片段，并采用盒式連接半巢式PCR技術(shù)擴增出ompn7基因，進行序列測定、生物信息學分析，同時采用基因打靶技術(shù)進行了功能的初步分析和探討。本研究既往工作的基礎(chǔ)上，對賴型鉤體omp/17基因進行擴增表達，制備抗血清，分析該基因在賴型鉤體體內(nèi)外和不同溫度下表達情況，同時對該蛋白進行表達純化

3、，采用構(gòu)建血管內(nèi)皮細胞基底膜進行血細胞的趨化分析，以及采用酵母雙雜交技術(shù)釣取ompn7基因在體內(nèi)相互作用的靶蛋白，為闡明鉤體分子致病機制作出新的探索。 本研究以SSH技術(shù)篩選并采用半巢式PCR擴增獲得的賴型鉤體017株特異性外膜蛋白新基因Ompll7(GenBank，登錄號為AF534704)，提取賴型鉤體017株基因組，根據(jù)Ompll7 ORF閱讀框架設計引物擴增獲得Ompll7基因，進行原核表達，將表達產(chǎn)物免疫動物獲得抗血清

4、，建立動物模型分析該基因在體內(nèi)表達情況，以及該基因在不同溫度下的表達情況，分析提示可能與鉤體毒力有關(guān)。 為了研究鉤體017株外膜蛋白新基因omp/17與鉤體肺大出血的相關(guān)性，將Ompl17基因擴增后在大腸桿菌JMl09中進行融合表達，并將表達后產(chǎn)物進行純化，純化后進行酶切，得到純的omp/17基因表達產(chǎn)物。然后構(gòu)建血管內(nèi)皮基底膜，觀察該蛋白對血細胞的趨化作用，實驗表明該蛋白對血細胞具有一定的趨化作用。 為了闡明鉤體致病

5、的分子機制，尋找鉤體致病的信號傳導通路，發(fā)現(xiàn)ompl17基因表達產(chǎn)物在體內(nèi)相互作用的靶蛋白。采用酵母雙雜交技術(shù)分別構(gòu)建誘餌質(zhì)粒載體和血管內(nèi)皮細胞cDNA文庫，通過順序性轉(zhuǎn)染，并采用缺陷性培養(yǎng)基，獲得了12個克隆，將克隆進行PCR擴增進行測序，然后將序列進行生物信息學分析，尋找真正的陽性克隆，并通過GenBank進行序列分析，發(fā)現(xiàn)有三種序列與相關(guān)蛋白有一定的同源性，但是還需要具體的進一步實驗論證。 本研究首次采用酵母雙雜交技術(shù)進行

6、問號賴型鉤端螺旋體強毒株017外膜蛋白差異新基因omp/17的靶蛋白分析，同時采用重構(gòu)血管基底膜，分析該基因表達蛋白與賴型鉤體肺大出血的相關(guān)性，為進一步證實其為毒力基因提供了證據(jù)。酵母雙雜交技術(shù)的應用則為致病鉤體毒力相關(guān)基因功能、分子免疫、遺傳進化等發(fā)病機制研究提供了新的思路和技術(shù)手段。同時制備該基因表達產(chǎn)物的抗血清，分析該基因的免疫性和該基因在體外不同溫度下和動物模型上的表達分布，進一步闡明該基因可能為毒力相關(guān)基因，為鉤體新型疫苗的研