雞羽根角蛋白在體組織工程化神經(jīng)——材料研制及前期實驗研究.pdf

1、近年來，周圍神經(jīng)損傷的發(fā)生率趨于增高，探尋用以修復周圍神經(jīng)缺損并替代自體神經(jīng)移植這一金標準的材料研究倍受關注。 研究發(fā)現(xiàn)，“神經(jīng)再生小室”為神經(jīng)再生提供了一個良好的、相對封閉的微環(huán)境，并能阻滯瘢痕形成。神經(jīng)橋接管較好地解決了這一問題。 用來橋接周圍神經(jīng)缺損的材料應具備以下條件：①良好的生物相容性：材料及其降解產(chǎn)物對組織細胞無毒、無“三致”、無明顯抗原性；②生物可降解性；③良好的表面粘附活性；④足夠的生物力學性能。

2、 國內(nèi)外學者在該領域做了大量研究：從單一材料到復合材料，從非生物降解吸收材料到生物可降解吸收材料，主要包括天然材料、人工合成材料及復合材料等。這些材料在神經(jīng)修復中雖取得了一定效果，但至今仍未有一種應用于臨床的、產(chǎn)業(yè)化的神經(jīng)橋接材料。 目前較受關注的是可降解吸收的天然生物材料和人工合成的高分子聚合材料。天然生物材料，即天然高分子材料或其復合物，主要指從動物結締組織或皮膚中提取的，經(jīng)特殊化學處理的，具有活性或特殊性能的蛋白質(zhì)，如膠原

3、、明膠、甲殼素、淀粉、纖維素、透明質(zhì)酸等；人工合成的可降解高分子材料如聚乳酸(PLA)等，具有可標準化生產(chǎn)、可降解、組織相容性好等優(yōu)點。但其酸性降解產(chǎn)物可能對周圍細胞活性產(chǎn)生不利影響，同時其親水性、細胞相容性、力學強度等均尚待改進。 最近我們提出“在體/原位組織工程”新概念，即：將可吸收生物支架材料植入體內(nèi)，并通過材料本身和/或其降解產(chǎn)物活化周圍組織的成體干細胞，利用體內(nèi)微環(huán)境和精確的調(diào)節(jié)機制在體誘導分化和培養(yǎng)種子細胞，“原位”

4、構建相應的組織或器官，從而克服了傳統(tǒng)的體外組織工程化組織或器官構建存在的問題。我們設想以雞羽根為材料構建在體組織工程化神經(jīng)，并獲得廣東省自然科學基金的資助。本研究即為該項目的前期研究。 研究包括：制備可降解吸收的雞羽根角蛋白(CCK)，觀察雞羽根角蛋白的形態(tài)結構，組織相容性及其毒性，以及生物可降解性，為雞羽根角蛋白橋接缺損神經(jīng)以及之后的產(chǎn)業(yè)化提供數(shù)據(jù)。 第一部分雞羽根角蛋白的制備及形態(tài)學觀察 目的 了解雞羽根角蛋

5、白的結構特點 方法 1.雞羽根的獲得：健康活體雞羽，取規(guī)格類似的羽根。 2.雞羽根角蛋白管的制備：序貫的、可控性理化處理程序。 3.形態(tài)學觀察：石蠟切片HE染色、光學顯微鏡/掃描電鏡術。 結果 1.新鮮雞羽根：腔內(nèi)有內(nèi)容物，有一定的水分，較柔韌。 2.未處理雞羽根(干燥后)：質(zhì)硬，不易切斷，淡黃色，半透明，內(nèi)容物呈現(xiàn)薄膜螺旋樣結構，與管腔易分離。 3.處理后雞羽根：質(zhì)柔韌，

6、乳白色，不透明，較易切斷。 4.雞羽根顯微結構：橫斷面，從內(nèi)到外依次分為四個致密層：①嗜堿性均質(zhì)狀粗線(0.5～1μm寬)；②3～5層的嗜酸性角質(zhì)層；③60～100層含大量色素顆粒的環(huán)行角蛋白束；④10～20層含少量色素顆粒的角蛋白束。處理前、后的雞羽根在光鏡下的結構未見明顯區(qū)別。 5.雞羽根掃描電鏡觀察： 未處理的雞羽根：結構致密，管壁較平整，無孔洞。 處理后的雞羽根：結構較疏松，角蛋白束橫縱交錯，可見

7、大小、深淺不等的孔洞。 結論 1.未處理雞羽根：天然管腔，由多層角蛋白束構成，含色素顆粒和少量基質(zhì)，結構致密，不利于直接用作生物材料。 2.處理后雞羽根：外觀呈現(xiàn)許多孔洞，結構疏松、角蛋白束交錯排列，可能為組織工程備用材料，需進一步研究。 第二部分雞羽根角蛋白管毒性作用的觀察 目的 觀察雞羽根角蛋白管的毒性作用 方法 1.雞羽根角蛋白管浸提液的制備： 1)雞羽根角蛋白管的制

8、備：采用序貫的、可控性理化程序不同程度(輕、中、重)的處理，制備相應的羽根角蛋白管。 2)浸提液制備：將上述3種羽根角蛋白管按每6cm2表面積分別加入9％氯化鈉注射液或MEM培養(yǎng)基lml，37℃下浸泡72h，即得浸提液。 2.浸提液化學特性：Lowry's法測定蛋白質(zhì)和肽類物質(zhì)總量；紫外吸收法測定其280nm和254nm處的光吸收及其比值；改良的Γабризлян紫外吸收法測定中分子肽含量；Ellman法測定巰基含量。

9、 3.皮膚致敏實驗：將2cm×2cm規(guī)格的濾紙分別浸泡在3種雞羽根角蛋白浸提液(實驗組，n=6)、9％氯化鈉注射液(陰性對照，n=6)及甲醛溶液(陽性對照，n=6)中浸透后待用。分別貼于SD大鼠背部脫毛皮膚，6h后移去濾紙，24h和48h后觀察實驗部位的情況。每周重復一次，連續(xù)3周。 4.皮內(nèi)刺激實驗：家兔脊柱兩側皮下分別注射3種雞羽根角蛋白浸提液(實驗組，n=5點)、9％氯化鈉注射液(對照組，n=5點)，24h、48h、

10、72h后觀察局部組織反應。 5.小鼠全身急性毒性實驗：昆明小鼠腹腔內(nèi)分別注射(50ml/kg)3種雞羽根角蛋白浸提液(實驗組，n=5)和9％氯化鈉注射液(對照組，n=5)，4、24、48、72h時觀察動物的一般狀況、毒性表現(xiàn)和死亡數(shù)。 6.細胞毒性實驗：在96孔L929細胞培板內(nèi)分別加入3種雞羽根角蛋白的培養(yǎng)基浸提液(實驗組，n=8)和MEM培養(yǎng)液(對照組，n=8)，于2，4，6d時觀察細胞情況(MTT法)。 結

11、果 1.9％氯化鈉注射液為浸提介質(zhì)的浸提液外觀變化不明顯，MEM培養(yǎng)基為浸提介質(zhì)的浸提液外觀上由紅色變?yōu)榉奂t色，pH值波動不大。 2.雞羽根浸出液中釋放物質(zhì)主要成份為中等分子量的肽類物質(zhì)，大分子蛋白釋放不多。 3.皮膚致敏實驗：皮膚無紅斑、水腫和壞死。 4.皮內(nèi)刺激實驗：皮內(nèi)無紅斑水腫現(xiàn)象。 5.小鼠全身急性毒性實驗：未出現(xiàn)死亡、衰竭、發(fā)紺、震顫、嚴重的腹部刺激、眼瞼下垂，呼吸困難等毒性、癥狀。

12、 6.細胞毒性實驗：細胞毒性接近于0級。 結論雞羽根角蛋白管可被水解，釋放一些肽類物質(zhì)，其浸提液對皮膚無致敏作用，皮內(nèi)刺激反應弱，不引起全身急性毒性癥狀，無細胞毒性。 第三部分雞羽根角蛋白植入后的形態(tài)學觀察 目的 觀察雞羽根角蛋白在活體組織內(nèi)的降解及其對周圍組織的影響 方法 1.SD大鼠背部肌組織內(nèi)分別植入雞羽根角蛋白片(輕、中、重)(實驗組，n=6)和未處理羽根片(對照組，n=6)，1w、

13、4w、8w、12w時取材(含周圍組織)，常規(guī)組織切片染色，光鏡下形態(tài)學觀察； 2.SD大鼠坐骨神經(jīng)束間分別植入雞羽根角蛋白絲(輕、中、重)(實驗組，n=6)和未處理羽根絲(對照組，n=6)，3w、8w時取材，常規(guī)組織切片染色，光鏡下形態(tài)學觀察，冰凍切片行Nestin免疫組化觀察。 結果 1.不論肌組織內(nèi)植入還是神經(jīng)束間植入，實驗動物都未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。 2.形態(tài)學觀察： 1）肌組織內(nèi)植入：1w包膜形

14、成，分界清，可見大量炎性細胞浸潤；4w材料呈條絲狀劈開，仍有炎性細胞；8w材料呈細絲狀或散在細顆粒狀，進一步降解吸收，仍有少量炎性細胞，可見多核巨細胞；12w材料降解顯著，材料被分成細小的碎片。對照組各時間段材料結構完整。 2)神經(jīng)束間植入：3w、8w引起的組織反應與細胞類型同肌組織內(nèi)植入，均未完全降解，實驗組材料對神經(jīng)纖維無不良影響，而對照組神經(jīng)纖維出現(xiàn)自溶現(xiàn)象。Nestin免疫組化未檢測到陽性結果。 結論 1