運(yùn)用整合組學(xué)研究HPV與宮頸癌.pdf

1、宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。每年全球新發(fā)病例超過(guò)50萬(wàn)，且其中80％來(lái)自發(fā)展中國(guó)家。根據(jù)中國(guó)衛(wèi)計(jì)委官方網(wǎng)站公布的2011年衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)年鑒數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)2010年宮頸癌總患病率為15.1/10萬(wàn)人，與往年相比呈上升趨勢(shì)。宮頸癌以鱗癌為主，其次為腺癌，有文獻(xiàn)報(bào)道同期的宮頸腺癌與宮頸鱗癌相比生存率更低，預(yù)后更差。流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，高危型人乳頭瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）感染是宮頸癌發(fā)生的重要啟動(dòng)因

2、子。乳頭瘤病毒是增殖在皮膚和粘膜層狀細(xì)胞上的一種小DNA病毒。按照臨床分析，人乳頭瘤病毒可以分為高危型和低危型兩大類。高危型HPV或稱致瘤HPV能夠?qū)е掳┌Y;目前已經(jīng)鑒定出了12種以上的高危型HPV，其中HPV16和HPV18與約70％HPV引起的宮頸癌有關(guān)。雖然過(guò)去的研究已經(jīng)明確了高危型HPV與宮頸癌之間的相關(guān)性，然而對(duì)于高危型HPV的致癌機(jī)理，尚缺乏對(duì)HPV病毒影響宿主細(xì)胞的宏觀認(rèn)識(shí)。而伴隨著測(cè)序技術(shù)和高分辨率質(zhì)譜技術(shù)的日益成熟，人

3、們有機(jī)會(huì)通過(guò)高通量測(cè)序和全蛋白質(zhì)譜分析等手段對(duì)HPV的致癌機(jī)制進(jìn)行更為全面的認(rèn)識(shí)。據(jù)此，我們將上述兩種新技術(shù)與其他分子生物學(xué)技術(shù)整合應(yīng)用，獲得了宮頸癌，HPV表達(dá)細(xì)胞和宮頸癌細(xì)胞系的轉(zhuǎn)錄組，蛋白組信息，并對(duì)HPV在以上兩個(gè)層面所發(fā)揮的致癌作用進(jìn)行了初步的探究。
　　目的:
　　獲得宮頸癌組織樣本或HPV癌基因表達(dá)細(xì)胞/宮頸癌細(xì)胞系的轉(zhuǎn)錄組，蛋白組信息，比較它們與正常組織或正常細(xì)胞系之間的差異，并檢測(cè)HPV與這些差異之間的相關(guān)

4、性。
　　方法:
　　1.對(duì)HPV癌基因細(xì)胞系進(jìn)行RNA測(cè)序:對(duì)穩(wěn)定表達(dá)高危型HPVE7基因的NIKS-E7及其對(duì)照NIKS-Vector細(xì)胞進(jìn)行RNA提取，對(duì)所得RNA進(jìn)行測(cè)序并定量。
　　2.對(duì)RNA測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析:從RNA測(cè)序的結(jié)果中挑選出E7細(xì)胞與Vector細(xì)胞有明顯表達(dá)差異，且能夠表達(dá)為蛋白的基因。對(duì)這些基因進(jìn)行GO(Gene Ontology)聚類。并用RTq-PCR驗(yàn)證RNA測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確性。

5、
　　3..對(duì)宮頸癌細(xì)胞系進(jìn)行蛋白樣本制備:分別從宮頸鱗癌SiHa和宮頸腺癌HeLa細(xì)胞系中提取細(xì)胞全蛋白，并用FASP方法進(jìn)行蛋白酶解。
　　4.對(duì)宮頸癌細(xì)胞系進(jìn)行蛋白組分析:將上述兩種細(xì)胞系的肽段進(jìn)行LCMS分析，并對(duì)所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行非標(biāo)記定量，對(duì)定量數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)過(guò)RNA測(cè)序，共發(fā)現(xiàn)236個(gè)基因在有HPV癌基因E7的細(xì)胞中與對(duì)照細(xì)胞相比存在明顯差異表達(dá)，其中高表達(dá)基因150

6、個(gè)，低表達(dá)基因86個(gè)
　　2.經(jīng)過(guò)GO聚類分析，高表達(dá)基因中38％與細(xì)胞周期相關(guān)，30％與DNA代謝相關(guān);低表達(dá)基因中約15％與細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)相關(guān)，14％與細(xì)胞穩(wěn)態(tài)相關(guān)。
　　3.經(jīng)過(guò)質(zhì)譜分析，在HeLa和SiHa之中共鑒定到2373種蛋白，其中在HeLa細(xì)胞中共鑒定到符合多肽可信度假陽(yáng)性率(FDR)≤0.05的蛋白1401種。在SiHa細(xì)胞中共鑒定到符合多肽可信度FDR≤0.05的蛋白1620種。
　　4.在上述蛋白中

7、，在兩種細(xì)胞中有明顯表達(dá)差異的蛋白，滿足p≤0.05的蛋白共787種，其中HeLa高表達(dá)蛋白401種，HeLa低表達(dá)蛋白386種。HeLa高表達(dá)蛋白中有10.8％的蛋白與提高產(chǎn)能代謝相關(guān)，在Hela低表達(dá)的蛋白中，有14.3％的蛋白同調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1.HPV癌基因能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖和細(xì)胞代謝，從而促進(jìn)癌癥的發(fā)生。
　　2.HPV感染所導(dǎo)致的腺癌和鱗癌有明顯的蛋白表達(dá)差異，這些差異很可能是導(dǎo)致腺癌預(yù)后