宮頸癌中高危型HPV整合位點的鑒定及機制研究.pdf

1、本文內容主要分為四部分：
　　第一部分:以宮頸癌細胞系為基礎建立 HPV整合位點研究體系
　　目的:
　　人乳頭瘤病毒(human papillomavirus, HPV)與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展關系密切。本研究通過DIPS-PCR(Detection of integrated papillomavirus sequences by ligation-mediated PCR)法檢測Siha和Hela細胞中HPV整合位點,

2、以判斷該技術能否用于DNA水平HPV整合位點的檢測。
　　方法:
　　本研究首先從Siha和Hela細胞系中提取基因組DNA,DIPS法檢測Siha和Hela細胞中HPV整合位點,并用熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)進行驗證。
　　結果:
　　通過DIPS-PCR檢測Siha和Hela細胞中的HPV整合位點,發(fā)現(xiàn)HPV16整合于Siha細胞系13q22

3、.1位點;HPV18整合于Hela細胞系8q24.21位點,與既往文獻報道一致。此外,熒光原位雜交的結果驗證了Siha細胞系13q22.1位點的整合位點和Hela細胞系8q24.21的整合位點。
　　結論:
　　DIPS-PCR法可在DNA水平檢測HPV整合位點,且該檢測結果可以由熒光原位雜交所驗證。
　　第二部分在臨床樣本中篩選及鑒定高危型 HPV的特定整合位點
　　目的:
　　人乳頭瘤病毒16型(hum

4、an papillomavirus16, HPV16)在宿主的整合狀態(tài)與宮頸癌的發(fā)生密切相關。本研究將DIPS-PCR技術應用到臨床標本上,以檢測HPV16病毒在宿主基因組上的整合位點,為進一步研究HPV潛伏持續(xù)感染導致宮頸癌變的分子基礎和調控機制奠定理論基礎。
　　方法:
　　從宮頸癌臨床標本中提取基因組DNA,并進行臨床標本HPV分型。用DIPS-PCR技術檢測HPV16陽性標本中HPV病毒DNA整合位點,并用Nimbl

5、eGen目標區(qū)域捕獲測序進行驗證。
　　結果:
　　在125例宮頸癌標本中,發(fā)現(xiàn)65例標本呈HPV16陽性。在HPV16陽性的65例臨床標本中,有55例標本檢測到HPV整合。其中,14例標本整合在3p14位點,8例標本整合在Xp22.1位點,其余標本呈隨機整合。取6例有3p14位點整合的標本進行捕獲測序,有3例標本驗證出3p14位點整合。此外,捕獲測序結果表明HPV16對3p14位點的整合可引起宿主基因組的不穩(wěn)定性。

6、　　結論:
　　HPV16易整合至人染色體3p14位點及Xp22.1位點,并導致宿主基因組的不穩(wěn)定性,從而可能成為宮頸癌發(fā)生的重要誘因之一。
　　第三部分通過建立鋅指核酶技術研究 HPV定點整合的分子機制
　　目的:
　　由于HPV病毒不能體外培養(yǎng),目前尚缺乏合適的研究HPV感染與整合的模型。為了進一步研究高危型HPV整合導致正常宮頸上皮細胞發(fā)生癌變的具體分子機制,本研究旨在建立鋅指核酶(Zinc-finger

7、nucleases,ZFN)基因組修飾體系。
　　方法:
　　本研究首先針對EGFP基因,設計并構建相應鋅指核酶,在細胞外及Siha細胞內破壞EGFP基因;另一方面,本研究通過鋅指核酶的切割向Hela細胞基因組中定點敲入EGFP基因。
　　結果:
　　靶向EGFP基因的鋅指核酶可在細胞外切割EGFP基因的全長,同時在Siha細胞系內可破壞導入的EGFP基因,致使表達綠色熒光蛋白的細胞比例降低。通過鋅指核酶對Hel