宮頸癌中高危型HPV整合位點(diǎn)的鑒定及機(jī)制研究.pdf

1、本文內(nèi)容主要分為四部分：
　　第一部分:以宮頸癌細(xì)胞系為基礎(chǔ)建立 HPV整合位點(diǎn)研究體系
　　目的:
　　人乳頭瘤病毒(human papillomavirus, HPV)與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。本研究通過DIPS-PCR(Detection of integrated papillomavirus sequences by ligation-mediated PCR)法檢測(cè)Siha和Hela細(xì)胞中HPV整合位點(diǎn),

2、以判斷該技術(shù)能否用于DNA水平HPV整合位點(diǎn)的檢測(cè)。
　　方法:
　　本研究首先從Siha和Hela細(xì)胞系中提取基因組DNA,DIPS法檢測(cè)Siha和Hela細(xì)胞中HPV整合位點(diǎn),并用熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果:
　　通過DIPS-PCR檢測(cè)Siha和Hela細(xì)胞中的HPV整合位點(diǎn),發(fā)現(xiàn)HPV16整合于Siha細(xì)胞系13q22

3、.1位點(diǎn);HPV18整合于Hela細(xì)胞系8q24.21位點(diǎn),與既往文獻(xiàn)報(bào)道一致。此外,熒光原位雜交的結(jié)果驗(yàn)證了Siha細(xì)胞系13q22.1位點(diǎn)的整合位點(diǎn)和Hela細(xì)胞系8q24.21的整合位點(diǎn)。
　　結(jié)論:
　　DIPS-PCR法可在DNA水平檢測(cè)HPV整合位點(diǎn),且該檢測(cè)結(jié)果可以由熒光原位雜交所驗(yàn)證。
　　第二部分在臨床樣本中篩選及鑒定高危型 HPV的特定整合位點(diǎn)
　　目的:
　　人乳頭瘤病毒16型(hum

4、an papillomavirus16, HPV16)在宿主的整合狀態(tài)與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)。本研究將DIPS-PCR技術(shù)應(yīng)用到臨床標(biāo)本上,以檢測(cè)HPV16病毒在宿主基因組上的整合位點(diǎn),為進(jìn)一步研究HPV潛伏持續(xù)感染導(dǎo)致宮頸癌變的分子基礎(chǔ)和調(diào)控機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　從宮頸癌臨床標(biāo)本中提取基因組DNA,并進(jìn)行臨床標(biāo)本HPV分型。用DIPS-PCR技術(shù)檢測(cè)HPV16陽(yáng)性標(biāo)本中HPV病毒DNA整合位點(diǎn),并用Nimbl

5、eGen目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果:
　　在125例宮頸癌標(biāo)本中,發(fā)現(xiàn)65例標(biāo)本呈HPV16陽(yáng)性。在HPV16陽(yáng)性的65例臨床標(biāo)本中,有55例標(biāo)本檢測(cè)到HPV整合。其中,14例標(biāo)本整合在3p14位點(diǎn),8例標(biāo)本整合在Xp22.1位點(diǎn),其余標(biāo)本呈隨機(jī)整合。取6例有3p14位點(diǎn)整合的標(biāo)本進(jìn)行捕獲測(cè)序,有3例標(biāo)本驗(yàn)證出3p14位點(diǎn)整合。此外,捕獲測(cè)序結(jié)果表明HPV16對(duì)3p14位點(diǎn)的整合可引起宿主基因組的不穩(wěn)定性。

6、　　結(jié)論:
　　HPV16易整合至人染色體3p14位點(diǎn)及Xp22.1位點(diǎn),并導(dǎo)致宿主基因組的不穩(wěn)定性,從而可能成為宮頸癌發(fā)生的重要誘因之一。
　　第三部分通過建立鋅指核酶技術(shù)研究 HPV定點(diǎn)整合的分子機(jī)制
　　目的:
　　由于HPV病毒不能體外培養(yǎng),目前尚缺乏合適的研究HPV感染與整合的模型。為了進(jìn)一步研究高危型HPV整合導(dǎo)致正常宮頸上皮細(xì)胞發(fā)生癌變的具體分子機(jī)制,本研究旨在建立鋅指核酶(Zinc-finger

7、nucleases,ZFN)基因組修飾體系。
　　方法:
　　本研究首先針對(duì)EGFP基因,設(shè)計(jì)并構(gòu)建相應(yīng)鋅指核酶,在細(xì)胞外及Siha細(xì)胞內(nèi)破壞EGFP基因;另一方面,本研究通過鋅指核酶的切割向Hela細(xì)胞基因組中定點(diǎn)敲入EGFP基因。
　　結(jié)果:
　　靶向EGFP基因的鋅指核酶可在細(xì)胞外切割EGFP基因的全長(zhǎng),同時(shí)在Siha細(xì)胞系內(nèi)可破壞導(dǎo)入的EGFP基因,致使表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞比例降低。通過鋅指核酶對(duì)Hel