結(jié)直腸癌PTP1B表達(dá)的意義及其與PI3Kp85α、AKT2、FAK、Survivin、Ki67的相關(guān)性研究.pdf

1、結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類的生命和健康。近年來隨著人們生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈逐年增加的趨勢。全球每年新增病例1，200，000例，每年死亡病例608，700例，其中澳大利亞、新西蘭、歐洲和北美洲發(fā)病率最高，在中國結(jié)直腸癌發(fā)病率在惡性腫瘤中僅次于肺癌和胃癌居第三位，死亡率居第五位。研究表明，如果結(jié)直腸癌能在早期階段被發(fā)現(xiàn)，約

2、90％的病人可以通過外科手術(shù)治愈，但由于絕大多數(shù)患者發(fā)病早期無明顯癥狀，經(jīng)常是在進(jìn)展期才被診斷，所以嚴(yán)重影響了結(jié)直腸癌的治療和預(yù)后，因此，加強(qiáng)尋找與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后相關(guān)的分子標(biāo)志物對其早期診斷、臨床分期、個體化治療方案制定及預(yù)后評估具有重要臨床意義。
　　酪氨酸磷酸化是信號傳導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)中的重要調(diào)節(jié)步驟，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、生存、分化、遷移和凋亡等過程。酪氨酸磷酸化由蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kin

3、ases，PTKs)和蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosinephosphatases，PTPs)協(xié)同調(diào)控，當(dāng)PTP表達(dá)或活性調(diào)控失常時，可導(dǎo)致信號通路紊亂，從而促進(jìn)多種疾病的發(fā)生，包括腫瘤、糖尿病和炎癥等。PTP1B是PTPs超家族成員之一，最初是作為一個分子量為37KDa的催化結(jié)構(gòu)域從人胎盤組織中所提取，PTP1B基因定位于人20號染色體q13，在許多癌癥中發(fā)現(xiàn)該區(qū)域存在癌基因和基因增殖。PTP1B是一種典型的非跨膜性蛋白

4、酪氨酸磷酸酶，在代謝信號通路中起重要作用，被認(rèn)為是抗2型糖尿病和肥胖的潛在靶點。越來越多的研究表明PTP1B與腫瘤具有相關(guān)性，最近的多數(shù)研究表明，其在腫瘤的發(fā)生中具有促進(jìn)作用。例如，PTP1B在胃癌細(xì)胞中過表達(dá)，抑制PTP1B的表達(dá)在體內(nèi)外可明顯抑制胃癌細(xì)胞的生長，PTP1B在胃癌組織中的過表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移和TNM分期密切相關(guān)。此外，PTP1B還在多種腫瘤中存在過表達(dá)，如上皮來源的腫瘤、卵巢癌、乳腺癌和前列腺癌。然而也有研究表明PTP1B

5、可能是個腫瘤抑制因子，與癌旁正常粘膜相比，PTP1BmRNA在食管癌中的表達(dá)明顯下降。因此PTP1B在腫瘤的發(fā)生中的作用仍存爭議，需要進(jìn)一步探討。關(guān)于PTP1B與結(jié)直腸癌關(guān)系，有研究表明，PTP1B在結(jié)腸癌細(xì)胞中過度表達(dá)，其過表達(dá)可通過激活Src增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞的致瘤性。另有研究表明，shRNA-PTP1B有效沉默結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞PTP1BmRNA及蛋白的表達(dá)。然而，有關(guān)PTP1B在人類結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)、PTP1B表達(dá)與臨床病理參數(shù)

6、和預(yù)后的關(guān)系及PTP1B在結(jié)直腸癌中作用目前鮮有報道。
　　細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常激活是腫瘤細(xì)胞的重要生物學(xué)特性。磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinaseB，PKB或Akt)信號途徑是一條與細(xì)胞的生長、增殖和分化密切相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。近年來研究表明，該通路在人類多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。其異常激活不僅可導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，而且在

7、腫瘤血管形成、腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移及腫瘤細(xì)胞的凋亡中起重要作用。研究表明，PTP1B可激活c-Src蛋白，而c-Src蛋白可激活與細(xì)胞存活相關(guān)的PI3K/AKT通路。黏著斑激酶(FAK)是一種非受體蛋白酪氨酸激酶，參與細(xì)胞發(fā)育、生長、凋亡等過程的調(diào)控，F(xiàn)AK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的一個交匯點。近年來研究表明，在多種腫瘤組織中都有FAK蛋白表達(dá)的顯著增加，F(xiàn)AK介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用，研究顯

8、示，抑制PTP1B的活性能明顯降低FAK的磷酸化。
　　細(xì)胞的增殖和凋亡失衡與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，Ki67是一種由MKI67基因編碼的核蛋白，在細(xì)胞周期G2、S、G1和M期均有表達(dá)，而G0期缺如。該蛋白與細(xì)胞增殖和核糖體RNA的轉(zhuǎn)錄相關(guān)。Ki67常用來評價腫瘤的增殖狀態(tài)，由于增殖狀態(tài)與腫瘤侵襲性密切相關(guān)，所以Ki67被作為多種腫瘤的預(yù)后標(biāo)記物。生存素(Survivin)屬于凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apoptos

9、is protein，IAP)家族，是新近發(fā)現(xiàn)的一種凋亡抑制因子，具有抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的雙重作用。Survivin表達(dá)于胚胎和發(fā)育的胎兒組織，成人終末分化組織無表達(dá)，但在多種人類常見惡性腫瘤中高表達(dá)，包括胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌和肺癌，與腫瘤的侵襲性和臨床進(jìn)展過程有關(guān)。
　　為了探討PTP1B在結(jié)直腸癌中表達(dá)的臨床意義及其與PI3Kp85α、AKT2、FAK、Survivin、Ki67的相關(guān)性，本研究

10、應(yīng)用免疫組織化學(xué)法、Western blot及實時熒光定量PCR技術(shù)檢測結(jié)直腸癌組織和對應(yīng)癌旁正常組織中PTP1B蛋白和mRNA的表達(dá)，結(jié)合病例臨床病理資料，分析其與各臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系。用實時熒光定量PCR檢測結(jié)直腸癌組織和對應(yīng)癌旁正常組織中PI3K/AKT信號通路中PI3Kp85α、Akt2的mRNA表達(dá)、FAK信號通路中FAK的mRNA表達(dá)、增殖相關(guān)抗原Ki67及凋亡相關(guān)基因Survivin的mRNA的表達(dá)，并采用Weste

11、rn blot法驗證PI3Kp85α、Akt2、FAK、Survivin蛋白水平的表達(dá)，分析PTP1B mRNA與PI3Kp85α、Akt2、FAK、Survivin和Ki67的mRNA表達(dá)的相關(guān)性。為結(jié)直腸癌的早期診斷、臨床治療和預(yù)后評估提供了一定的理論依據(jù)。
　　本課題三部分的具體內(nèi)容如下:
　　第一部分、PTP1B在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其臨床意義
　　目的:檢測PTP1B蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)，探討其與結(jié)直腸癌

12、各臨床病理因素及預(yù)后之間的關(guān)系，為評估結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展、預(yù)后及治療提供理論依據(jù)。
　　方法:運用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測PTP1B蛋白在96例結(jié)直腸癌組織及對應(yīng)癌旁正常組織中的表達(dá)情況，分析其與患者性別、年齡、腫瘤發(fā)病部位、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期及預(yù)后的關(guān)系。用統(tǒng)計軟件SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　(1)PTP1B在62例結(jié)直腸癌組織和27例對應(yīng)癌旁無癌組織中呈高表達(dá)，而在34

13、例結(jié)直腸癌組織和69例對應(yīng)癌旁無癌組織中低表達(dá)或陰性表達(dá)，卡方檢驗顯示組間差異性有統(tǒng)計學(xué)意義(x2=25.65，P＜0.01)。
　　(2)PTP1B在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與腫瘤分化程度(x2=4.084，P=0.043)，浸潤深度(x2=4.608，P=0.032)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(x2=5.061，P=0.024)，TNM分期(x2=5.724，P=0.017)有關(guān)，而與性別、年齡和腫瘤部位無關(guān)（P＞0.05）。
　　(3)

14、Kaplan-Meier分析顯示，PTP1B高表達(dá)的患者生存期短于低表達(dá)患者(P=0.012)。單因素分析結(jié)果顯示，PTP1B高表達(dá)(P=0.018)，TNM分期(P＜0.001)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P＜0.001)，浸潤深度(P=0.012)，分化程度(P=0.001)與不良預(yù)后相關(guān)。Cox模型多因素分析結(jié)果顯示，PTP1B表達(dá)(P=0.045)，TNM分期(P=0.015)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.014)是結(jié)直腸癌預(yù)后的獨立因素。
　

15、　結(jié)論:
　　(1)PTP1B蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)顯著高于對應(yīng)癌旁正常組織，并與分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)，PTP1B在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展及浸潤轉(zhuǎn)移中起促進(jìn)作用。
　　(2)PTP1B蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與患者的年齡、性別及腫瘤部位無關(guān)。
　　(3)PTP1B是判斷結(jié)直腸癌預(yù)后的獨立因素。
　　第二部分、結(jié)直腸癌中PTP1B表達(dá)與PI3Kp85α、Akt2和FAK表達(dá)的相關(guān)性研究

16、r>　　目的:檢測PTP1B、PI3Kp85α、Akt2和FAK mRNA在結(jié)直腸癌及對應(yīng)癌旁正常組織的表達(dá)水平，并驗證其蛋白在在結(jié)直腸癌及對應(yīng)癌旁正常組織中的表達(dá)。分析上述指標(biāo)mRNA表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系以及結(jié)直腸癌組織中PTP1BmRNA表達(dá)與PI3Kp85α、Akt2和FAK的mRNA表達(dá)的相關(guān)性，探討結(jié)直腸癌組織中PTP1B與PI3K/Akt和FAK兩大細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中相關(guān)分子的關(guān)系。
　　方法:采用

17、實時熒光定量PCR技術(shù)檢測結(jié)直腸癌組織及對應(yīng)癌旁正常組織中的PTP1B、PI3Kp85α、Akt2和FAK的mRNA表達(dá)水平，并采用Western blot法驗證PTP1B、PI3Kp85α、Akt2和FAK蛋白水平的表達(dá)，分析PTP1B、PI3Kp85α、Akt2和FAK的mRNA表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤發(fā)病部位、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及TNM分期的關(guān)系。分析結(jié)直腸癌組織中PTP1BmRNA表達(dá)與PI3Kp85α、Akt

18、2和FAK的mRNA表達(dá)的相關(guān)性，應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。采用配對t檢驗對PTP1B、PI3Kp85α、Akt2和FAK的mRNA在結(jié)直腸癌組織及對應(yīng)癌旁正常組織中表達(dá)的差異進(jìn)行分析;采用兩個獨立樣本t檢驗法檢驗上述基因與患者不同臨床病理參數(shù)間的關(guān)系;采用Pearson相關(guān)分析檢測PTP1BmRNA與PI3Kp85α、Akt2、FAK的mRNA表達(dá)的相關(guān)性。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:<

19、br>　　(1)PTP1B、PI3Kp85α、Akt2和FAK的mRNA在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平均高于對應(yīng)癌旁正常組織，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＜0.01)。
　　(2) PTP1B、PI3Kp85α、Akt2和FAK蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)明顯高于對應(yīng)癌旁正常組織中的表達(dá)。
　　(3)PTP1BmRNA在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與腫瘤分化程度(t=3.288，P＜0.01)，浸潤深度(t=4.613，P＜0.01)，淋巴

20、結(jié)轉(zhuǎn)移(t=4.841，P＜0.01)，TNM分期(t=4.841，P＜0.01)有關(guān)，而與性別、年齡和腫瘤部位無關(guān)(P＞0.05）。
　　(4)PI3Kp85α mRNA在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與浸潤深度(t=2.972，P＜0.01)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(t=2.106，P＜0.01)，TNM分期(t=2.106，P＜0.01)有關(guān)，而與性別、年齡、腫瘤部位和腫瘤分化程度無關(guān)(P＞0.05)。
　　(5)Akt2 mRNA在結(jié)直腸

21、癌組織中的表達(dá)與浸潤深度(t=2.843，P＜0.01)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(t=2.335，P＜0.01)，TNM分期(t=2.335，P＜0.01)有關(guān)，而與性別、年齡、腫瘤部位和腫瘤分化程度無關(guān)（P＞0.05）。
　　(6)FAK mRNA在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與浸潤深度(t=3.805，P＜0.01)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(t=3.254，P＜0.01)，TNM分期(t=3.254，P＜0.01)有關(guān)，而與性別、年齡、腫瘤部位和腫瘤分化程度

22、無關(guān)(P＞0.05）。
　　(7)PTP1B與PI3Kp85α、Akt、FAK的mRNA表達(dá)均呈正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為，PTP1B-PI3Kp85α: r=0.576, P＜0.01; PTP1B-Akt2:r=0.649,P＜0.01;PTP1B-FAK: r=0.702,P＜0.01。
　　結(jié)論:
　　(1)PTP1B、PI3Kp85α、Akt2和FAK的mRNA及蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平均高于對應(yīng)癌旁正

23、常組織，提示它們可能均參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生。
　　(2)癌組織分化程度越低、浸潤程度越深、臨床分期越高以及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織中PTP1BmRNA相對表達(dá)量越高，說明PTP1B可能參與了結(jié)直腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移和惡化。
　　(3)浸潤越深、臨床分期越高以及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織中PI3Kp85α、Akt2和FAK的mRNA相對表達(dá)量越高，說明三者可能與結(jié)直腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移和惡化密切相關(guān)。
　　(4)PTP1B mRN

24、A與PI3Kp85α、Akt2和FAK的mRNA在結(jié)直腸癌中的表達(dá)均具有正相關(guān)關(guān)系，提示它們可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移過程中具有協(xié)同作用。
　　(5) PTP1B在結(jié)直腸癌的高表達(dá)可能與PI3K/AKT和FAK所介導(dǎo)的信號通路異常激活有關(guān)。
　　第三部分、結(jié)直腸癌組織中PTP1B表達(dá)與Survivin和Ki67表達(dá)的相關(guān)性研究
　　目的:檢測結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織中Survivin和Ki67的mRNA表達(dá)

25、情況，并采用Western blot法驗證Survivin蛋白水平的表達(dá)，分析Survivin和Ki67mRNA表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，以及結(jié)直腸癌組織中PTP1BmRNA表達(dá)與Survivin和Ki67的mRNA表達(dá)的相關(guān)性，探討結(jié)直腸癌組織中PTP1B表達(dá)與增殖和凋亡的關(guān)系。
　　方法:采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測結(jié)直腸癌組織及對應(yīng)癌旁正常組織中的Survivin和Ki67的mRNA表達(dá)水平，并采用Wester

26、n blot法驗證Survivin蛋白水平的表達(dá)，分析Survivin和Ki67的mRNA表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤發(fā)病部位、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期的關(guān)系以及結(jié)直腸癌組織中PTP1BmRNA表達(dá)與Survivin和Ki67的mRNA表達(dá)的相關(guān)性。應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。采用配對t檢驗對Survivin和Ki67的mRNA在結(jié)直腸癌組織及對應(yīng)癌旁正常組織中表達(dá)的差異進(jìn)行分析;采用兩個獨立樣

27、本t檢驗法檢驗上述基因與患者不同臨床病理參數(shù)間的關(guān)系;采用Pearson相關(guān)分析檢測PTP1BmRNA與Survivin、Ki67的mRNA表達(dá)的相關(guān)性。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　(1)Survivin和Ki67的mRNA在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平均高于對應(yīng)癌旁正常組織，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＜0.01)。
　　(2) Survivin蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)明顯高于對應(yīng)癌旁正常組織中的

28、表達(dá)。
　　(3)Survivin mRNA在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與浸潤深度(t=2.421，P＜0.01)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(t=3.086，P＜0.01)，TNM分期(t=3.086，P＜0.01)有關(guān)，而與性別、年齡、腫瘤部位和腫瘤分化程度無關(guān)（P＞0.05）。
　　(4)Ki67 mRNA在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(t=2.356，P＜0.01)，TNM分期(t=2.356，P＜0.01)有關(guān)，而與性別、年齡、腫瘤

29、部位、腫瘤分化程度和浸潤深度無關(guān)(P＞0.05）。
　　(5)PTP1B與Ki67和Survivin的mRNA表達(dá)均呈正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為，PTP1B-Ki67:r=0.398，P＜0.05; PTP1B-Survivin: r=0.615，P＜0.01。
　　結(jié)論:
　　(1)Survivin和Ki67的mRNA在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平均高于對應(yīng)癌旁正常組織，提示它們可能均參與結(jié)直腸癌的發(fā)生。
　　(2

30、)癌組織浸潤越深、臨床分期越高以及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織中SurvivinmRNA相對表達(dá)量越高，說明Survivin可能參與了結(jié)直腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移。
　　(3)臨床分期越高以及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織中Ki67的mRNA相對表達(dá)量越高，說明Ki67可能參與了結(jié)直腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移。
　　(4)PTP1BmRNA與Survivin和Ki67的mRNA在結(jié)直腸癌中的表達(dá)均具有正相關(guān)關(guān)系，提示它們在促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展，浸潤和