HIF-1α-HIF-2α在惡性上皮性卵巢腫瘤中的表達(dá)及其對耐藥機(jī)制影響的初步研究.pdf

1、卵巢癌是嚴(yán)重威脅婦女健康的常見惡性腫瘤之一。在我國，卵巢癌的發(fā)病率在婦科惡性腫瘤中處第三位，死亡率居第一位。卵巢癌細(xì)胞原發(fā)性或繼發(fā)性對多種化療藥物耐藥是治療失敗的重要原因。
　　越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境與腫瘤的形成、發(fā)展以及腫瘤對治療的抵抗密切相關(guān)。缺氧作為惡性腫瘤微環(huán)境的基本特征之一，廣泛存在于各種實(shí)體腫瘤中?，F(xiàn)有的研究證實(shí)，缺氧可以通過多種途徑誘導(dǎo)腫瘤耐藥，而作為細(xì)胞缺氧感受分子的缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxiainduci

2、ble factor，HIF)在缺氧調(diào)控中處于中心地位，介導(dǎo)了大部分缺氧應(yīng)激反應(yīng)，使腫瘤細(xì)胞在適應(yīng)惡劣環(huán)境的同時(shí)表現(xiàn)出對藥物的抵抗，成為逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的治療靶點(diǎn)。
　　HIF-1和HIF-2是HIF家族中的主要成員，都由不同功能亞基HIF-a和共有的HIF-β亞基共同組成。但已有的研究顯示兩者在分布存在差異;進(jìn)一步研究表明，兩者有不同的功能。這些提示兩者在缺氧應(yīng)激反應(yīng)調(diào)控中可能存在獨(dú)立性和協(xié)同性。盡管有關(guān)兩者在結(jié)構(gòu)、分布以及功能的比

3、較性研究已經(jīng)在不同腫瘤中開展。但在卵巢癌中，HIF-1和HIF-2的分布是否存在差異，仍缺乏大樣本研究數(shù)據(jù)證實(shí)。如果存在差異，是什么原因?qū)е律胁坏枚?。這種差異對卵巢癌細(xì)胞耐藥性形成產(chǎn)生何種影響，尚不清楚。
　　本研究從缺氧這一腫瘤特有的微環(huán)境出發(fā)，通過檢測上皮性卵巢腫瘤中HIF-1α、HIF-2α和多藥耐藥基因1(Multidrug Resistance1MDR1)產(chǎn)物P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)的表達(dá)，

4、了解HIF-1α和HIF-2α與腫瘤耐藥的關(guān)系。同時(shí)，利用CoCl2營造體外缺氧環(huán)境，建立卵巢癌SKOV-3細(xì)胞缺氧耐藥細(xì)胞模型。通過檢測缺氧過程中，HIF-1α、HIF-2α和P-gp的表達(dá)變化，探討在慢性缺氧微環(huán)境中，HIF-1α和HIF-2α在上皮性卵巢癌耐藥性形成中的作用。
　　第一部分，HIF-1α、 HIF-2α和P-gp在上皮性卵巢腫瘤中的表達(dá)
　　目的:明確HIF-1α、HIF-2α和P-gp在上皮性卵巢腫瘤

5、中的表達(dá)，初步分析HIF-1α、HIF-2α和P-gp與上皮性卵巢腫瘤臨床病理的聯(lián)系以及三者間的相互關(guān)系。
　　方法:按照嚴(yán)格的準(zhǔn)入標(biāo)準(zhǔn)，搜集2005年1月-2008年12月在湘雅二醫(yī)院手術(shù)，術(shù)后確診為原發(fā)性上皮性卵巢腫瘤的病例，一共175例。通過免疫組織化學(xué)法檢測HIF-1α、HIF-2α和P-gp在上皮性卵巢腫瘤中的表達(dá)。
　　結(jié)果:①在良性、交界性、惡性上皮性卵巢腫瘤中，HIF-1α的陽性率分別為46.15％、61.9

6、0％、78.72％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其表達(dá)強(qiáng)度的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。HIF-2α的陽性率分別為7.69％、47.62％、58.16％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，其表達(dá)強(qiáng)度的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。P-gp的陽性率分別為30.77％、38.10％、60.28％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其表達(dá)強(qiáng)度的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　?、谠跐{液性、粘液性和內(nèi)膜樣惡性上皮性

7、卵巢腫瘤中，HIF-1α、HIF-2α和P-gp的陽性率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。在高、中、低分化的惡性上皮性卵巢腫瘤中，HIF-1α、HIF-2α和P-gp的陽性率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。在Ⅰ-Ⅱ期和Ⅲ-Ⅳ期惡性上皮性卵巢腫瘤中，HIF-1α和P-gp的陽性率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）;在Ⅲ-Ⅳ期惡性上皮性卵巢腫瘤中，HIF-2α的陽性率為73.24％，高于其在Ⅰ-Ⅱ期惡性上皮性卵巢腫瘤中的陽性率(41.79％

8、)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　?、墼诰哂邢嗤毖跛降慕M織中，HIF-1α和HIF-2α的陽性率分別為78.72％和58.16％，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。在壞死區(qū)周邊組織中，HIF-2α的核陽性率(43.48％)高于HIF-1α(31.31％)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　?、軔盒陨掀ば月殉材[瘤中，HIF-1α與P-gp的表達(dá)呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.604(P＜0.01); HIF-2α

9、與P-gp的表達(dá)呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.575(P＜0.01)。
　　結(jié)論:①在上皮性卵巢腫瘤中，HIF-1α和HIF-2α陽性率增加提示腫瘤惡性程度增高，HIF-2α的表達(dá)強(qiáng)度越強(qiáng)提示腫瘤惡性程度越高;②HIF-2α高表達(dá)提示惡性上皮性卵巢腫瘤進(jìn)展;③在同一缺氧水平下，HIF-1α陽性率高于HIF-2a，兩者的陽性率存在差異，提示缺氧對HIF-1α和HIF-2a的表達(dá)存在不同影響;④惡性上皮性卵巢腫瘤中HIF-1α和HIF-2

10、α均與P-gp的表達(dá)呈正相關(guān)。
　　第二部分，卵巢癌細(xì)胞SKOV-3體外缺氧模型構(gòu)建及缺氧對順鉑療效的影響
　　目的:利用CoCl2模擬腫瘤缺氧，建立卵巢癌上皮細(xì)胞SKOV-3體外缺氧模型并檢測缺氧狀態(tài)下順鉑對其抑制率的影響。
　　方法:用含0、25、50、100、150、200、250 umol/L CoCl2的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞SKOV-3。用MTT法檢測不同濃度CoCl2對卵巢癌細(xì)胞SKOV-3的抑制情

11、況;Western Blot方法分別檢測缺氧和常氧條件下卵巢癌細(xì)胞SKOV-3中HIF-1α和HIF-2α蛋白表達(dá)情況。MTT法分別檢測缺氧組和常氧組中順鉑對卵巢癌細(xì)胞SKOV-3的抑制率。
　　結(jié)果:①隨CoCl2濃度增加，缺氧對卵巢癌細(xì)胞SKOV-3抑制率升高。
　　②與常氧組相比，缺氧處理后HIF-1α和HIF-2α蛋白表達(dá)明顯增加，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　?、垌樸K對卵巢癌細(xì)胞SKOV-3的抑制

12、率在常氧組為83.7％，在缺氧組為53.5％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);
　　結(jié)論:①采用CoCl2建立了卵巢癌細(xì)胞SKOV-3體外缺氧模型;
　　②缺氧誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞SKOV-3對順鉑耐藥。
　　第三部分，缺氧對HIF-1α和HIF-2α表達(dá)的影響及其與卵巢癌耐藥性形成的相關(guān)性研究
　　目的:檢測不同濃度CoCl2處理后，卵巢癌細(xì)胞SKOV-3中HIF-1α和HIF-2α的表達(dá)以及在不同缺氧時(shí)間作用下H

13、IF-1α、HIF-2α和P-gp的表達(dá)，探討慢性缺氧對HIF-1α和HIF-2α表達(dá)的影響以及HIF-1α和HIF-2α與P-gp在卵巢癌耐藥性形成中的作用。
　　方法:用含0、25、50、100、150、200、250 umol/L CoCl2的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)卵巢癌SKOV-3細(xì)胞，8h后提取mRNA和總蛋白。在缺氧模型中培養(yǎng)卵巢癌SKOV-3細(xì)胞0、2、4、8、12、24、48h后，分別提取mRNA和總蛋白。通過RT-P

14、CR和Western Blot檢測卵巢癌細(xì)胞SKOV-3中HIF-1α、HIF-2α以及P-gp mRNA和蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果:①隨CoCl2濃度增高，HIF-1α和HIF-2α mRNA及蛋白表達(dá)均增高;
　?、谌毖酰?h，HIF-1α、HIF-2α和P-gp mRNA及蛋白表達(dá)增高;缺氧≥8h，HIF-2α和P-gp mRNA和蛋白穩(wěn)定表達(dá)，而HIF-1α mRNA和蛋白表達(dá)降低。
　　結(jié)論:①不同濃度CoC