雷公藤甲素治療大數類風濕性關節(jié)炎的蛋白質組學研究.pdf

1、類風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關節(jié)及關節(jié)周圍組織慢性炎癥病變?yōu)橹饕憩F的自身免疫性疾病，是臨床多發(fā)病。
　　 RA發(fā)病特點是反復發(fā)作，病情纏綿，且有較高的致殘率，嚴重危害人類健康。近年來雖在RA發(fā)病機制及病理變化等研究領域取得了顯著進展，但是長期應用西藥治療，毒副作用大，療效不佳。中醫(yī)藥治療具有療效較好、毒副作用小的特點。因而，利用豐富的中醫(yī)藥資源，開發(fā)治療RA有效的方法和藥物，明確其治

2、療機制，有重要的科學意義和社會意義。
　　 RA屬于中醫(yī)頑痹范疇，其病因為外感寒濕之邪，氣血陰陽失調，臟腑虧損，寒濕凝滯，氣血運行不暢導致邪盛正虛、瘀滯挾雜引起關節(jié)腫脹、疼痛變形、晨僵等癥狀。中醫(yī)認為，氣行則血行，氣滯則血凝，不通則痛，通則不痛。人體正氣的強弱，對類風濕性關節(jié)炎的演變和預后起著重要作用。故治療原則應以整體出發(fā)，針對病因病機，扶正祛邪，寒熱并用，以祛風除濕，通絡散寒，扶正固本為基本治法。而對類風濕關節(jié)炎療效最為突出

3、的中藥首推雷公藤(TriPteyrgimu Wilofulii Hook F,TWHF)。
　　 雷公藤系衛(wèi)矛科雷公藤屬木質藤本植物，最早記載雷公藤功效的是公元1476年明朝蘭茂所著的滇南本草，書中稱其味辛，性溫，有毒，入肝脾十二經，行十二經絡，具有治筋骨疼痛，風寒濕痹，麻木不仁，癱瘓痿軟，濕氣流痰等功效，能緩解肢體的疼痛與拘攣等癥狀。雷公藤作為一種傳統(tǒng)中藥，具有活血化瘀、清熱解毒、消腫散結、殺蟲止血等功效，可以起到扶正以御邪氣

4、之作用，使RA之邪、虛、瘀得以治療，直中病機。
　　 雷公藤作為一種新的免疫抑制劑應用于臨床已有近30年。其中，環(huán)氧二萜內酯化合物—雷公藤甲素(triptolide，TP)被認為是最主要的抗炎和免疫抑制成分。藥理和臨床試驗表明其具有免疫抑制、抗炎等多種生物活性，為常用的改善病情類抗風濕藥，能緩解RA骨侵蝕，是治療RA的有效藥物。
　　 大量的臨床實驗證實，TP具有較好的抗炎作用，特別是對RA有很好的療效。TP治療RA(R

5、A)起效時間較快(平均2.57d)，用藥后能明顯減輕關節(jié)腫痛，改善關節(jié)功能障礙，降低血沉，控制發(fā)熱，并能部分或全部代替激素和/或非甾體抗炎藥物，且較之為優(yōu)(近期有效率達100％，顯效率為46.67％)。TP在劑量范圍0.05-0.3mg/kg時，無論是皮下注射、腹腔注射還是灌胃均能明顯抑制大鼠腹腔毛細血管通透性增加，對角叉菜膠性和甲醛性前足腫脹具有明顯的抑制作用，表明藥物對滲出性和增殖性炎癥均有療效。
　　 RA主要病理特點是滑

6、膜細胞增生，襯里層增厚，多種炎性細胞浸潤，血管翳形成，以及軟骨和骨組織的破壞，最終導致關節(jié)畸形和功能喪失。
　　 大量資料表明T淋巴細胞、巨噬細胞和增生的滑膜細胞在這種疾病的發(fā)病機制中起主要作用，其中滑膜成纖維細(Fibroblast-like synoviocyte，FLS)表型改變的機制成為RA發(fā)生機制研究的新熱點。
　　 現在已有大量的證據提示，FLS是RA的關鍵效應細胞，它們釋放多種效應分子作用于各種細胞(淋巴細

7、胞、單核細胞、間充質細胞)，降解細胞外基質并且向間充質細胞和浸潤免疫細胞提供趨化和活化信號。抑制FLS效應的治療策略可以顯著地減輕關節(jié)炎和預防骨的吸收。
　　 因此，TP治療RA療效確切。然而，TP治療RA的機制仍舊處于起步階段，詳細作用機制仍需深入探討。其中，TP抑制RA滑膜成纖維細胞增殖機制研究很少。在本研究中，我們對TP抑制RA滑膜成纖維細胞增殖作用進行驗證并利用蛋白質組學方法比較RA滑膜成纖維細胞受到TP刺激后發(fā)生上調或

8、下調的蛋白質，這將有利于揭示TP抑制RA滑膜成纖維細胞增殖的作用機制，將有助于為其臨床應用提供理論基礎，并有利于理解RA發(fā)生發(fā)展機制，為其臨床治療提供候選靶點。
　　 本課題采用的具體研究方案如下:
　　 (1)制作RA大鼠模型。
　　 本課題采用新的模型制作方法，熱殺死結核桿菌(Heat-killed myeobaeterium tuberculosis H37Ra，Mtb)誘導建立大鼠佐劑性關節(jié)炎模型，該模型

9、造模成功率高(可達100％)，關節(jié)炎癥發(fā)生時間早(注射Mtb后8天左右發(fā)生，15天達高峰)，實驗周期較短，是較為理想的研究藥物治療類風濕關節(jié)炎療效及其作用機理的模型。
　　 (2)研究TP對RA有關指標的影響。
　　 實驗隨機分為3組:空白對照組、模型對照組、TP組。采用HE染色法進行滑膜組織病理學檢查，觀察RA程度;在前期的基礎上，進一步應用LiquiChip蛋白液相芯片系統(tǒng)檢測RA的多種相關因子TGF、IGF-1、I

10、FN-γ、TNF-α、MCP-1、MIP-2、IL-1、IL-4、IL-6、IL-12、IL-13、IL-17、VCAM-1、ICAM-1等含量變化。
　　 (3)研究類風濕發(fā)生過程中的信號傳導網絡。
　　 取上述實驗各組的動物組織，提取總蛋白，應用蛋白質雙向凝膠電泳技術(Two-dimensional electrophoresis，2-DE)、質譜儀等蛋白組學相關技術和方法，篩選差異蛋白表達譜，然后應用免疫組化、We

11、stern Blot、Q-PCR等方法鑒定關鍵蛋白質，進一步弄清RA發(fā)生過程中的信號傳導網絡。
　　 本課題結果表明:
　　 (1)TP治療后，RA大鼠病變關節(jié)腫脹有顯著的消退。
　　 (2)TP治療后，RA大鼠細胞因子譜發(fā)生變化:模型組IL-1β、IL-6、TNF-α、MIP-1α血清水平明顯升高，而TP治療后顯著下降，模型組血清IL-4、IL-10顯著升高，而TP治療組相對于模型組顯著升高。
　　 (

12、3)經過蛋白質組學分析，篩選得到同時滿足下列條件的差異點5個:1)模型組與正常對照組之間存在差異;2)TP治療組上述1)差異點變化趨勢逆轉;3)變化趨勢1.5倍以上。差異點分別為:AnnexinA3、Cytoplasmic aconitate hydratase、Peroxiredoxin 6、Transgelin、LIM and SH3 domain protein 1。
　　 (4)經過Q-PCR、western-blot對

13、感興趣的蛋白質(Peroxiredoxin 6、Transgelin)進行驗證，表明其表達水平的變化與蛋白質組學分析一致。
　　 Annexin A3也被稱作lipocortin 3或placental anticoagulant protein 3是膜聯蛋白(annexin)家族的一員。
　　 Annexin家族是Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，是細胞內高豐度蛋白，約占細胞總蛋白的1％～2％;annexin是一種普遍存在的

14、細胞溶質蛋白，其以可溶形式和以通過與細胞骨架組成蛋白或調控細胞與細胞外基質相互作用蛋白的穩(wěn)定結合或可逆結合的形式存在。Annexin家族包括A，B，C，D和E5類，脊椎(哺乳)動物的annexin屬A類，被報道的有12種(annexinA1-A11和A13);無脊椎動物的屬B類;真菌和部分單細胞真核生物的屬C類;植物的annexin屬于D類;原核生物的annexin則屬于E類。Annexin家族成員參與抗凝血、抗炎、出胞入胞作用、信號轉

15、導、細胞增殖、分化和凋亡等多種生理活動。
　　 Annexin表達失調與人類疾病相關，其表達水平的改變或其定位的改變可引起病態(tài)或產生疾病。Annexin在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，可介導細胞信號通路、細胞運動、腫瘤的侵襲轉移、血管生成、細胞凋亡及抗藥性。
　　 我們推測:Annexin A3可能在RA關節(jié)滑膜細胞表達釋放細胞因子、MMP等方面發(fā)揮作用，導致滑膜細胞增殖、侵襲能力增加等。
　　 Transgelin是一種未

16、知功能的22 kDa蛋白質，也被命名為SM22。該蛋白質曾在多種樣本中被鑒別出，并在鼠p27、WS3-10、膠轉蛋白和SM22的一些不同命名下對其進行了研究。物種間的基因和蛋白質序列高度保守，且在果蠅和秀麗隱桿線蟲中鑒別出同源性。膠轉蛋白是肌動結合蛋白鈣調蛋白家族中的一種，存在于細胞骨架中。
　　 Transgelin是一種肌動蛋白壓力纖維素相關的蛋白質，與凝膠劑起反應并能穩(wěn)定體外的肌動蛋白凝膠劑。它還與平滑肌中的激動蛋白絲有相

17、關性。考慮到膠轉蛋白是一種最早的平滑肌細胞分化標志物且其與肌動蛋白有關，很久之前就假設它有調節(jié)這些細胞發(fā)育和收縮的功能。但是，無膠轉蛋白(SM22-/-)的小鼠能正常發(fā)育、繁殖，且沒有出現血壓、心率、組織學或組織形態(tài)學上的任何改變。不過，對無膠轉蛋白小鼠血管平滑肌的進一步檢查發(fā)現小鼠對興奮劑誘導的、鈣獨立收縮的收縮性反應度增加。膠轉蛋白可能也涉及到細胞的轉移。膠轉蛋白也可能與細胞的移動有關。已證明其與肌動蛋白絲束的一種特異性亞群有關聯，

18、而肌動蛋白絲束足體會形成足體。該事實表明鈣調蛋白的缺失能引起鈣調蛋白與膠轉蛋白轉化率的降低，從而有利于足體的形成并致使細胞向侵略性、惡性細胞方向發(fā)展。
　　 最近的證據表明某些細胞中的腫瘤抑制功能與膠轉蛋白有關，而與細胞骨架本身沒有關系。在前列腺腫瘤細胞中，已顯示膠轉蛋白能通過阻止雄性激素受體聯合活化劑與雄性激素受體的結合來抑制雄性激素所刺激的細胞生長，以及隨后向細胞核的移位。膠轉蛋白也有抑制間質金屬蛋白酶MMP-9表達的作用。

19、MMP-9涉及到組織的重組過程，而組織的重組導致癌癥細胞的移動和對周圍組織的侵犯。
　　 由于我們的實驗結果表明膠轉蛋白在TP治療RA大鼠關節(jié)滑膜組織中表達發(fā)生改變，而膠轉蛋白可能與MMP-9的表達相關，因此，我們推測TP作用于關節(jié)滑膜組織，可能影響轉膠蛋白表達，通過影響MMP-9表達，而發(fā)揮抑制骨質破壞的作用。
　　 總結:通過蛋白質組學技術，我們找到一些可能參與TP治療RA的蛋白質，一些蛋白目前已有文獻報道與RA發(fā)生