抗TNF-α和Il-1β IgY抗體治療豚鼠過(guò)敏性支氣管哮喘的研究.pdf

1、目的：
　　 探討抗TNF-α和IL-1βIgY抗體霧化吸入治療過(guò)敏性支氣管哮喘的作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 1、應(yīng)用卵清蛋白(OVA)霧化吸入法建立Hartley豚鼠過(guò)敏性支氣管哮喘模型。
　　 2、霧化吸入抗TNF-α和IL-1βIgY抗體及布地奈德混懸液。
　　 3、隨機(jī)分為五組：正常對(duì)照組(C組)；過(guò)敏性支氣管哮喘組(M組)；0.1％抗TNF-α和IL-1βIgY抗體治療組(Z1組)；

2、1.0％抗TNF-α和IL-1βIgY抗體治療組(Z2組)；布地奈德混懸液治療組(常規(guī)藥物陽(yáng)性治療組)(Z3組)。
　　 4、觀察各組用藥治療前后1h的活動(dòng)、進(jìn)食、噴嚏、抓鼻、咳嗽、呼吸頻率和呼吸深度等一系列變化。
　　 5、所有實(shí)驗(yàn)組豚鼠于末次治療結(jié)束后第2、4、8、24小時(shí)等4個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死，取右肺做病理切片，經(jīng)HE染色，觀察肺組織病理變化。
　　 6、所有實(shí)驗(yàn)組豚鼠于術(shù)次治療結(jié)束后第2、4、8、24小時(shí)等4個(gè)

3、時(shí)間點(diǎn)處死，左肺行支氣管肺泡生理鹽水灌注，收集肺泡灌沈液(BALF)測(cè)定細(xì)胞因子及IgE含量。
　　 7、采用雙抗夾心ELISA方法檢測(cè)BALF中TNF-α、IL-1、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13、IL-16和TGF-β等細(xì)胞因子和IgE的含量。
　　 8、應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)采用X±SD表示。對(duì)各組不同時(shí)間之間先進(jìn)行χ2正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)，若符合正態(tài)分布和方差齊性，

4、則采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，多重比較再采用LSD檢驗(yàn)。若不符合正態(tài)分布和方差不齊性，則采用多重秩和檢驗(yàn)，多重比較用Mann-Whiteney法。相關(guān)性檢驗(yàn)使用Pearson方法。取P<0.05表示差異有顯著性。進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果：
　　 1、應(yīng)用卵清蛋白(OVA)霧化吸入法建立Hartley豚鼠過(guò)敏性支氣管哮喘模型成功。
　　 2、動(dòng)物行為學(xué)觀察：模型組(M組)動(dòng)物在霧化吸入致敏

5、后表現(xiàn)比較興奮，煩躁不安，摩擦皮毛，抓鼻、噴嚏、咳嗽現(xiàn)象；0.1％抗TNF-α和IL-1βIgY抗體治療組(Z1組)、1.0％抗TNF-α和IL-1βIgY抗體治療組(Z2組)、布地奈德混懸液(常規(guī)藥物陽(yáng)性治療組)(Z3組)動(dòng)物進(jìn)食、飲水、活動(dòng)在治療后較M組動(dòng)物明顯改善。
　　 3、肺組織病理學(xué)檢查：
　　 C組各時(shí)間點(diǎn)下的肺組織在光鏡下可見(jiàn)氣道壁和肺泡壁結(jié)構(gòu)完整，毛細(xì)血管密集，管腔通暢；肺泡腔內(nèi)清潔透亮，肺泡上皮細(xì)胞排

6、列有序；肺泡上皮與毛細(xì)血管及其間質(zhì)成份結(jié)構(gòu)完整并構(gòu)成完整的肺泡呼吸膜；各級(jí)支氣管周?chē)匆?jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　 M組動(dòng)物各時(shí)間點(diǎn)下的肺支氣管、肺泡壁和肺泡腔結(jié)構(gòu)不完整；毛細(xì)血管發(fā)生擴(kuò)張，白細(xì)胞明顯增多；肺泡腔發(fā)生大面積破裂，腔內(nèi)可見(jiàn)滲出液，包括壞死的肺泡上皮細(xì)胞，并有白細(xì)胞浸潤(rùn)；支氣管管壁平滑肌細(xì)胞肥大和增生，基底膜顯著增厚并玻璃樣變；肺間質(zhì)有淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　 Z1組和Z2組肺泡管和肺泡壁結(jié)構(gòu)結(jié)

7、構(gòu)較完整；肺泡形態(tài)較M組規(guī)則，肺泡腔內(nèi)偶見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞游離于其中；肺泡毛細(xì)血管內(nèi)炎性細(xì)胞較M組明顯減少；支氣管粘膜有部分增厚現(xiàn)象，管壁平滑肌細(xì)胞較M組明顯減少；支氣管管腔內(nèi)及管腔旁?xún)H可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　 Z3組和M組比較肺泡結(jié)構(gòu)破壞減少。Z1組、Z2組、Z3組之間相比較形態(tài)結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯的差別。
　　 4、BALF細(xì)胞因子變化：
　　 2h：M組各細(xì)胞因子含量高于C組(P<0.05)，IL-1含量高于其他各

8、組(P<0.05)；TNF-α含量高于Z1、Z2組(P<0.05)；IL-16含量高于Z1、Z3組(P<0.05)；IL-4、IL-8、TGF-β含量高于Z3組(P<0.05)；IgE含量高于Z1組(P<0.05)。Z1、Z2、Z3各組IL-1、IL-6、IL-10含量各組間無(wú)顯著性差異；Z3組IL-4、IL-13含量低于Z1、Z2組(P<0.05)，而TNF-α含量高于Z1、Z2組(P<0.05)；Z2組IL-16、IgE含量高于Z1

9、、Z3組(P<0.05)；Z3組TGF-β含量低于Z1、Z2組(P<0.05)。
　　 4h：M組IL-1、IL-4、IL-6、IgE含量高于其他各治療組(P<0.05)；IL-8、IL-13、TNF-α含量高于Z2、Z3組(P<0.05)；IL-16含量高于Z1、Z3組(P<0.05)；TGF-β含量高于Z1、Z2組(P<0.05)。Z1、Z2、Z3各組在IL-1、IL-13、IgE含量各組間無(wú)顯著性差異；Z2組IL-4、IL

10、-6含量高于Z1組(P<0.05)；Z1組IL-8、含量高于Z2、Z3組(P<0.05)；IL-16含量Z2組顯著高于Z1、Z3組(P<0.05)，而TGF-β含量顯著低于Z1、Z3組(P<0.05)。Z3組TNF-α低于Z1、Z2組(P<0.05)。Z3組TNF-α、TGFβ低于Z1、Z2組(P<0.05)。
　　 8h：M組在IL-1、IL-4、IL-6、IL-8、IL-13、IL-16、TNF-α、TGF-β含量均顯著高于

11、Z1、Z2、Z3組(P<0.05)，IgE顯著高于Z2、Z3組(P<0.05)。Z1、Z2、Z3各組在IL-1、IL-6、IL-8、IL-13、IL-16含量各組間無(wú)顯著性差異；Z3組IL-4含量顯著低于Z1組(P<0.05)；Z3組TNF-α含量顯著低于Z1組，高于C組、Z2組(P<0.05)；Z2組TNF-α、IgE含量顯著低于Z1組(P<0.05)。
　　 24h：M組在IL-1、IL-4、IL-6、IL-8、IL-13、

12、IL-16、TNF-α、TGF-β、IgE仍顯著高于C組(P<0.05)；IL-1、IL-4、IL-6、IL-13、IL-16、TNF-α、TGF-β、IgE顯著高于Z3組(P<0.05)；IL-4、IL-6、IL-8、IL-13、IL-16、TGF-β、IgE顯著高于Z2組(P<0.05)；IL-4、TGF-β也顯著高于Z1組(P<0.05)。Z3組在IL-1含量顯著低于Z1、Z2組(P<0.05)；TNF-α含量顯著高于Z1、Z2組

13、(P<0.05)；IL-4含量顯著高于Z2組(P<0.05)；IL-6、IL-13、IgE含量低于Z1組(P<0.05)。Z2組在IL-4、IL-6、IL-13、IL-16、IgE含量低于Z1組(P<0.05)。IL-1在Z1、Z2組含量高于C組(P<0.05)，IL-4在Z2組含量高于C組(P<0.05)，IL-13、IL-16在Z1組含量高于C組(P<0.05)，TNF-α在Z2、Z3組含量顯著高于C組(P<0.05)，IgE在Z1

14、、Z2、Z3組含量高于C組(P<0.05)。
　　 IL-10在2h、4h、8h、24h各組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但在M組IL-4/IL-10比值在2h、4h、8h、24h分別為0.86、1.08、0.86、0.83，均高于C組在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的IL-4/IL-10比值0.54、0.54、0.48、0.73。Z1組IL-4/IL-10比值在2h、4h、8h、24h分別為1.34、0.56、0.71、0.75；Z2組IL-4/IL-10比

15、值在2h、4h、8h、24h分別為0.98、0.68、0.53、0.57，Z1組、Z2組2h高于M組(0.86)，其他時(shí)間點(diǎn)均低于M組(p<0.05)；Z3組IL-4/IL-10比值在2h、4h、8h、24h分別為0.74、0.67、0.57、0.93，除了治療后期的24h高于M組(0.83)，其他時(shí)間點(diǎn)均低于M組(P<0.05)。從IL-4/IL-10比值看Z1、Z2、Z3組均低于M組，稍高于C組，說(shuō)明Z1、Z2、Z3組的IL-10相

16、對(duì)提高，出現(xiàn)過(guò)敏性炎癥的抑制。
　　 5、BALF中細(xì)胞因子的相關(guān)性：
　　 BALF中TNF-α與IL-1、IL-4、IL-8、IL-13、IL-16、IgE含量呈正相關(guān)(P<0.05)。BALF中IL-1與IL-4、IL-6、IL-8、IL-13、IL-16、TNF-α、TGF-β、IgE呈正相關(guān)(P<0.05)。BALF中IL-4與IL-1、IL-6、IL-8、IL-13、IL-16、TNF-α、TGF-β、IgE

17、呈正相關(guān)(P<0.05)。BALF中IL-6與IL-1、IL-4、IL-8、IL-13、IL-16、TGF-β、IgE呈正相關(guān)(P<0.05)。BALF中IL-8與IL-1、IL-4、IL-6、IL-13、IL-16、TNF-α、TGF-β、IgE呈正相關(guān)(P<0.05)。BALF中IL-10的變化與其他各細(xì)胞因子及IgE變化無(wú)相關(guān)性。BALF中IL-13與IL-1、IL-4、IL-6、IL-8、IL-16、TNF-α、TGF-β、Ig

18、E呈正相關(guān)(P<0.05)。BALF中IL-16與IL-1、IL-4、IL-6、IL-8、IL-13、TNF-α、TGF-β、IgE呈正相關(guān)(P<0.05)。BALF中IgE與IL-1、IL-4、IL-6、IL-8、IL-13、IL-16、TNF-α、TGF-β呈正相關(guān)(P<0.05)。BALF中TGF-β與IL-1、IL-4、IL-6、IL-8、IL-13、IL-16、IgE呈正相關(guān)(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　

19、 1、本文從動(dòng)物行為學(xué)表現(xiàn)、組織病理學(xué)切片觀察、以及致炎細(xì)胞因子(IL-1、IL-4、IL-6、IL-8、IL-13、IL-16、TNF-α、TGF-β)和抑炎細(xì)胞因子(IL-10)在BALF的含量變化證明，抗TNF-α和IL-1βIgY抗體霧化治療能夠有效地控制過(guò)敏性支氣管炎癥癥狀和體征，以及支氣管肺組織炎癥病理反應(yīng)。
　　 2、初步揭示了各種致炎和抑炎細(xì)胞因子在過(guò)敏性支氣管肺部炎癥中及病理過(guò)程中的變化及相互關(guān)系，在BALF

20、中的IL-4、IL-6、IL-8、IL-13、IL-16、TGF-β等細(xì)胞因子及IgE與TNF-α、IL-1的變化具有相關(guān)性，并初步證明TNF-α和IL-1β不但在過(guò)敏性支氣管肺炎病理過(guò)程中對(duì)組織產(chǎn)生損傷，而且是作為炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的啟動(dòng)因子。
　　 3、通過(guò)抗TNF-α和IL-1βIgY抗體霧化治療OVA致敏的支氣管哮喘模型豚鼠證明，其減少了肺組織局部IL-4、IL-6、IL-8、IL-13、IL-16和TGF-β等致炎細(xì)胞因子的