抗TNF-α和IL-1βIgY抗體治療豚鼠過敏性鼻炎的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　探討抗TNF-α及IL-1βIgY滴鼻治療過敏性鼻炎及改善肺組織炎癥的作用及其機(jī)制。
　　方法:
　　1、IgY抗體制備
　　2、應(yīng)用卵清蛋白腹腔注射致敏、滴鼻攻擊方法建立豚鼠過敏性鼻炎模型。
　　3、采用卵清蛋白皮內(nèi)注射方法鑒定豚鼠過敏性鼻炎模型。
　　4、豚鼠隨機(jī)分為正常對照組(C組),過敏性鼻炎模型組(M組),非特異性IgY治療組(Z1組),0.1％抗TNF-αIgY治療組(Z2組)

2、,0.1%抗IL-1βIgY治療組(Z3組),0.1%抗TNF-α和IL-1βIgY治療組(Z4組),丙酸氟替卡松治療組(Z5組)。每組治療結(jié)束后在2 h、4 h、8 h等三個時間點(diǎn)觀察結(jié)果。
　　5、C組(生理鹽水滴鼻攻擊)、M組、Z1組、Z2組、Z3組、Z4組、Z5組每次OVA滴鼻攻擊和治療時滴入IgY或生理鹽水后再滴入OVA滴鼻攻擊后30min內(nèi)通過肉眼觀察對豚鼠的癥狀(打噴嚏、抓鼻、流涕量)表現(xiàn),并進(jìn)行記錄和評分。

3、　　6、各組實(shí)驗(yàn)結(jié)束日末次治療和OVA激發(fā)后在2 h、4 h、8 h腹腔注射10%水合氯醛麻醉豚鼠,使用PBS緩沖液滴注豚鼠鼻腔進(jìn)行鼻灌洗,并抽取鼻灌洗液(NLF),離心,取上清和沉淀細(xì)胞。
　　7、各組實(shí)驗(yàn)結(jié)束日末次治療和OVA激發(fā)后在2 h、4 h、8 h腹腔注射10%水合氯醛麻醉豚鼠,采用心臟穿刺法抽取血液,抗凝,血涂片,離心取血漿。
　　8、各組實(shí)驗(yàn)結(jié)束日末次治療和OVA激發(fā)后在2 h、4 h、8 h處死豚鼠,對右肺

4、采用PBS緩沖液進(jìn)行支氣管肺泡灌洗,抽取支氣管肺泡灌洗液(BALF)離心取沉淀細(xì)胞。
　　9、各組實(shí)驗(yàn)結(jié)束日末次治療和OVA激發(fā)后在2 h、4 h、8 h處死豚鼠,分離鼻黏膜組織及左肺、4%多聚甲醛固定組織、石蠟包埋固定的組織、組織切片等,進(jìn)行病理檢查。
　　10、采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫法(ELISA)測定各組血漿、鼻灌洗液(NLF)中TNF-α、IL-1β、IL-5、IL-9、IL-13、IL-18、IL-22、IL-33、

5、TGF-β等炎癥細(xì)胞因子和Th2細(xì)胞因子,以及OVA特異性IgE含量。
　　11、采用Wright's染色法對血液、鼻灌洗液(NLF)、支氣管肺泡灌洗液(BALF)細(xì)胞涂片進(jìn)行染色,計數(shù)嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞數(shù)量。
　　12、采用HE染色法對鼻黏膜組織和肺組織切片進(jìn)行染色,觀察組織病理學(xué)變化以及組織嗜酸性粒細(xì)胞浸潤,并計數(shù)組織嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量。
　　13、采用免疫組織化學(xué)染色法對鼻黏膜組織和肺組織

6、切片進(jìn)行TNF-α、IL-1β、IL-5、IL-33染色,觀察組織細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-5、IL-33的表達(dá)量的變化。
　　14、采用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果:
　　1、經(jīng)卵清蛋白腹腔注射致敏、滴鼻攻擊建立Hartley豚鼠過敏性鼻炎模型的成功率為96.63%(172只/178只),豚鼠死亡率69.85%(183只/262只)。
　　2、與M組比較,Z2組、Z3組、Z

7、4組、Z5豚鼠OVA激發(fā)30min內(nèi)其過敏癥狀明顯減輕,抓鼻次數(shù)、打噴嚏數(shù)、以及流涕量逐漸減少(P<0.05);而C組豚鼠滴鼻生理鹽水時偶見輕度抓鼻,未見打噴嚏和流鼻涕癥狀。
　　3、鼻粘膜:正常對照組(C組)鼻粘膜固有層偶見淋巴細(xì)胞浸潤;0.1%抗TNF-α和IL-1βIgY治療組(Z4組)和丙酸氟替卡松治療組(Z5組)在嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤,粘膜層水腫,粘膜上皮細(xì)胞完整性等方面明顯輕于模型組(M組)和非特異性IgY治療組

8、(Z1組),同時也輕于0.1%抗TNF-αIgY治療組(Z2組)和0.1%抗IL-1βIgY治療組(Z3組),尤其是在8 h。
　　肺組織:正常對照組(C組)粘膜下層偶見淋巴細(xì)胞浸潤;0.1%抗TNF-α和IL-1βIgY治療組(Z4組)和丙酸氟替卡松治療組(Z5組)在嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤,支氣管粘膜細(xì)胞脫落,肺間質(zhì)水腫,肺泡管結(jié)構(gòu)受損,肺間隔增厚和斷裂,管壁平滑肌增厚等方面明顯輕于模型組(M組)和非特異性IgY

9、治療組(Z1組),同時也輕于0.1%抗TNF-αIgY治療組(Z2組)和0.1%抗IL-1βIgY治療組(Z3組),尤其是在8 h。
　　4、在2h、4h、8h時間點(diǎn)豚鼠鼻粘膜和肺組織中,嗜酸性粒細(xì)胞百分率在C組　　5、在鼻粘膜IL-1β、TNF-α、IL-5和IL-33的表達(dá)主要位于鼻粘膜上皮細(xì)胞和固有層的腺體細(xì)胞內(nèi),而在

10、肺組織IL-1β、TNF-α、IL-5和IL-33的表達(dá)主要位于肺泡和肺泡隔腺體細(xì)胞和支氣管粘膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi),其中IL-1β、IL-33在Z4組和Z5組表達(dá)量較M組、Z1組、Z2組和Z3組明顯降低,而M組與Z1組、以及Z4組與Z5組的表達(dá)量無明顯差異。
　　6、在外周血中2h的Z2、Z3、Z5組,8h的Z4組,嗜酸性粒細(xì)胞顯著低于M組(P<0.05)。
　　在鼻灌洗液中2h、4h、8h的Z2、Z3、Z4、Z5組嗜酸性粒細(xì)

11、胞顯著低于M組和Z1組(P<0.05);在2h的Z5組,在4h的Z3、Z4、Z5組,在8h的Z3、Z5組,嗜中性粒細(xì)胞顯著低于M組(P<0.05);在2h的Z4和Z5組,4h的Z4
　　組,8h的Z3和Z5組,淋巴細(xì)胞顯著低于M組(P<0.05)。
　　在支氣管肺灌洗液中2h的Z2、Z3、Z4、Z5組,4h和8h的Z3、Z4、Z5組嗜酸性粒細(xì)胞顯著低于M組(P<0.05);在2h的Z2、Z3、Z4組,Z5組,8h的Z4組,嗜

12、中性粒細(xì)胞顯著低于M組(P<0.05);在2h的Z1、Z3、Z4、Z5組,4h的Z3和Z5組,8h的Z5組,淋巴細(xì)胞顯著低于M組(P<0.05)。
　　7、在鼻灌洗液中2h時,Z2、Z3、Z4、Z5組IL-1β、TNF-α、IL-5、IL-9、IL-33等炎癥細(xì)胞因子和OVA特異性IgE抗體的含量顯著低于模型組(M組)和非特異性IgY治療組(Z1組);IL-13的含量在Z3、Z4、Z5組顯著低于M組、Z1和Z2組;IL-18、TG

13、F-β和IL-22的含量在Z2、Z3、Z4、Z5組顯著低于M組(P<0.05)。4h時,Z2、Z3、Z4、Z5組IL-1β、IL-5、IL-9、IL-33等炎癥細(xì)胞因子和OVA特異性IgE抗體的含量顯著低于模型組(M組)和非特異性IgY治療組(Z1組);IL-13的含量在Z3、Z4、Z5組顯著低于M組和Z2組;TNF-α的含量在Z2、Z3、Z4、Z5組顯著低于M組;TGF-β的含量在Z3、Z4、Z5組顯著低于M組;IL-22的含量在Z4

14、組和Z5組顯著低于M組(P<0.05)。8h時,Z2、Z3、Z4、Z5組IL-1β、IL-5、IL-9、TNF-α、IL-33的含量,Z3、Z4、Z5組IL-13和IL-22的含量,Z2、Z4、Z5組TGF-β的含量,Z4組OVA特異性IgE抗體的含量顯著低于模型組(M組)(P<0.05);Z2、Z3、Z4、Z5組IgE、IL-1β、IL-9、IL-22、TGF-β的含量,Z3、Z4、Z5組IL-5、IL-33、TNF-α的含量, Z5

15、組IL-13的含量顯著低于非特異性IgY治療組(Z1組)(P<0.05)。
　　8、在血漿中2h時,Z2、Z3、Z4、Z5組TNF-α、IL-13、TGF-β、IL-33等炎癥細(xì)胞因子和OVA特異性IgE抗體的含量顯著低于模型組(M組)和非特異性IgY治療組(Z1組)(P<0.05);Z2、Z3、Z4、Z5組IL-5、IL-9的含量,Z1組IL-9、IL-13、TNF-α的含量,Z3、Z4、Z5組IL-18的含量,以及Z4和Z5組

16、IL-1β的含量顯著低于模型組(M組)(P<0.05);Z3、Z4、Z5組IL-5,Z4組IL-9,Z3和Z4組IL-18,以及Z4和Z5組IL-1β、IL-22等炎癥細(xì)胞因子的含量顯著低于非特異性IgY治療組(Z1組)(P<0.05)。4h時,Z2、Z3、Z4、Z5組IL-5、IL-18、TGF-β、IL-22、IL-33等炎癥細(xì)胞因子的含量顯著低于模型組(M組)和非特異性IgY治療組(Z1組)(P<0.05);Z1、Z2、Z3、Z4

17、、Z5組的IL-13,Z2、Z3、Z4、Z5組的OVA特異性IgE,Z3、Z4、Z5組的IL-1β、IL-9,Z4組的TNF-α等炎癥細(xì)胞因子含量顯著低于模型組(M組)(P<0.05);Z2、Z4、Z5組的OVA特異性IgE,Z3、Z4、Z5組的IL-9,Z3和Z5組的IL-13,Z4和Z5組的IL-1β,Z4組的TNF-α等炎癥細(xì)胞因子含量顯著低于非特異性IgY治療組(Z1組)(P<0.05)。8h時, Z2、Z3、Z4、Z5組IL-

18、5、TGF-β、IL-33等炎癥細(xì)胞因子的含量顯著低于模型組(M組)和非特異性IgY治療組(Z1組)(P<0.05);Z5組的OVA特異性IgE抗體,Z4和Z5組的IL-1β、IL-9,Z1、Z2、Z3、Z4組的IL-13,Z4組的IL-18,Z2和Z5組的TNF-α,以及Z1、Z2、Z3、Z4、Z5組的IL-22等炎癥細(xì)胞因子含量顯著低于模型組(M組)(P<0.05);Z5組的OVA特異性IgE抗體,Z4和Z5組的IL-9, Z2、Z

19、3、Z4、Z5組的TNF-α、IL-18,以及Z2組的IL-22等炎癥細(xì)胞因子含量顯著低于非特異性IgY治療組(Z1組)(P<0.05)。
　　9、在血漿中炎癥細(xì)胞因子TNF-α與IL-1β(r=0.623,P<0.01)、IL-5(r=0.676,P<0.01)、IgE(r=0.703,P<0.01)、IL-9(r=0.634,P<0.01)、IL-13(r=0.541,P<0.01)、IL-18(r=0.703,P<0.01)

20、、TGF-β(r=0.779, P<0.01)、IL-22(r=0.324,P<0.01)、IL-33(r=0.723,P<0.01),以及IL-1β與IL-5(r=0.677,P<0.01)、IgE(r=0.723,P<0.01)、IL-9(r=0.745, P<0.01)、IL-13(r=0.576,P<0.01)、IL-18(r=0.558,P<0.01)、TGF-β(r=0.728,P<0.01)、IL-22(r=0.515,P

21、<0.01)、IL-33(r=0.750, P<0.01)等炎癥細(xì)胞因子的含量呈正相關(guān)。
　　在鼻灌洗液中炎癥細(xì)胞因子TNF-α與IL-1β(r=0.761,P<0.01)、IL-5(r=0.619,P<0.01)、IgE(r=0.657,P<0.01)、IL-9(r=0.736,P<0.01)、IL-13(r=0.549,P<0.01)、TGF-β(r=0.625,P<0.01)、IL-22(r=0.704, P<0.01)、I

22、L-33(r=0.691,P<0.01),以及IL-1β與TNF-α(r=0.761, P<0.01)、IL-5(r=0.754,P<0.01)、IgE(r=0.821,P<0.01)、IL-9(r=0.877,P<0.01)、IL-13(r=0.583,P<0.01)、IL-18(r=0.402,P<0.01)、TGF-β(r=0.721,P<0.01)、IL-22(r=0.719,P<0.01)、IL-33(r=0.779, P<0

23、.01)等炎癥細(xì)胞因子的含量呈正相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1、采用卵清蛋白(OVA)和氫氧化鋁凝膠腹腔注射基礎(chǔ)免疫,及OVA滴鼻加強(qiáng)免疫(攻擊或激發(fā))豚鼠成功地建立了穩(wěn)定的過敏性鼻炎豚鼠模型。
　　2、抗TNF-α和IL-1βIgY抗體滴鼻局部治療過敏性鼻炎模型豚鼠能夠有效地抑制由OVA誘導(dǎo)的過敏性鼻炎豚鼠鼻粘膜和肺組織過敏性炎癥病理反應(yīng)的發(fā)展,并減輕過敏性炎癥病理反應(yīng)程度。
　　3、抗TNF-α和IL-1βIgY

24、抗體治療豚鼠過敏性鼻炎的作用機(jī)制可能是通過抑制嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的增加和浸潤,減少IL-1β、TNF-α、TGF-β1、IL-5、IL-9、IL-13、IL-22、IL-33等原炎癥因子和Th2細(xì)胞因子,以及OVA特異性IgE抗體的水平而發(fā)揮作用。
　　4、卵清蛋白(OVA)誘導(dǎo)的過敏性鼻炎模型豚鼠并發(fā)過敏性哮喘的癥狀和過敏性炎癥病理改變,充分證明上下呼吸道過敏性炎癥的同步性、一致性,同時也證明治療的一