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
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文檔簡介
1、目的與背景
急性肺損傷是臨床上常見的急危重癥,目前仍缺少十分有效的治療措施。研究表明炎性細胞因子在急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展及預后中具有重要的作用,抑制炎癥因子的產(chǎn)生可以有效的減輕急性肺損傷程度,而抗腫瘤藥物丁酸鈉已初顯其在抗炎方面的作用。本課題旨在研究丁酸鈉在體外及體內(nèi)的抗炎作用及其機制,為急性肺損傷的治療提供一種新的藥物。
材料與方法
1.采集健康人外周血,分離培養(yǎng)外周血單個核細胞(PBMC)。在培養(yǎng)PBMC
2、的培養(yǎng)基中分別加入一定濃度的脂多糖(LPS)和/或丁酸鈉,24小時后收集不同組別的細胞上清液。酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測細胞上清液中TNF-α、IL-1β及IL-8的濃度,通過統(tǒng)計學分析丁酸鈉是否抑制LPS刺激的PBMC炎性因子的產(chǎn)生。
2.Balb/c小鼠氣管內(nèi)滴入LPS(1mg/kg)構(gòu)建急性肺損傷(ALI)模型。構(gòu)建ALI模型后,獲取支氣管肺泡灌洗液(BALF),采用ELISA法檢測BALF中TNF-α及IL-1
3、β的濃度;取肺組織,分別測肺濕干重比、行病理組織切片檢查、ELISA法檢測組織勻漿液中MPO及NO濃度。通過上述數(shù)據(jù)分析ALI小鼠模型構(gòu)建成功與否。
3.在小鼠氣管內(nèi)滴入LPS之前1h,采用灌胃法給予小鼠丁酸鈉(10mg/kg)或生理鹽水預處理。于小鼠接受LPS刺激后的各個時間點獲取BALF,用ELISA法檢測BALF中TNF-α及IL-1β的濃度;獲取肺組織,分別測肺濕干重比、行病理組織切片檢查、ELISA法檢測組織勻漿液中
4、MPO及NO濃度、WesternBlot法檢測肺組織細胞核內(nèi)及胞漿核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB的亞基NF-κBp65的表達情況。通過上述結(jié)果探討丁酸鈉在體內(nèi)的抗炎作用及機制。
研究結(jié)果
1.體外丁酸鈉的抗炎作用:PBMC在LPS刺激下TNF-α、IL-1β及IL-8均生成增多,分別達223.5±13.5pg/ml、106.2±10.6pg/ml和89.1±6.9pg/ml,均較空白對照及單純丁酸鈉處理組顯著增高,組間存在
5、顯著差異(p<0.05)。在給予LPS刺激前,預先行丁酸鈉預處理可以顯著抑制TNF-α、IL-1β及IL-8的產(chǎn)生,其濃度分別為130.9±10.4pg/ml、57.7±8.6pg/ml和48.6±5.5pg/ml,該組與空白對照及單純丁酸鈉組間存在顯著差異(p<0.05)。
2.ALI小鼠模型的建立:小鼠麻醉后,經(jīng)氣管滴入LPS(1mg/kg)構(gòu)建ALI小鼠模型。模型建立后3h,ELISA法檢測ALI小鼠BALF中TNF-α
6、及IL-1β的濃度分別為3678±16pg/ml和638±23pg/ml,空白對照組(氣管內(nèi)滴入生理鹽水)BALF中TNF-α及IL-1β的濃度分別為119±9pg/ml和46±6pg/ml,ALI小鼠模型BALF中炎性因子TNF-α及IL-1β濃度較空白對照組顯著增高,存在顯著性差異(p<0.05)。ELISA法檢測ALI小鼠肺組織勻漿液中MPO的活性及NO的濃度分別為44.2±2.3uIU/ml和92.8±2.4umol/L,空白對
7、照組肺組織勻漿液中MPO的活性及NO的濃度分別為5.5±0.8uIU/ml和5.0±0.8umol/L,ALI小鼠模型肺組織勻漿液中MPO活性及NO濃度較對照組顯著提高,存在顯著性差異(p<0.05)。ALI小鼠肺濕干重比為5.32±0.38,空白對照組肺濕干重比為4.22±0.23,ALI小鼠模型肺濕干重比較空白對照組明顯增高,存在顯著性差異(p<0.05)。ALI小鼠肺組織的病理學觀察:廣泛的肺泡壁水腫、增厚,肺泡內(nèi)出血,肺泡塌陷及
8、明顯的炎性細胞浸潤??瞻讓φ战M肺組織的病理學觀察表現(xiàn)為正常的肺組織病理學特點。
3.丁酸鈉體內(nèi)的抗炎作用及機制:ELISA法檢測經(jīng)丁酸鈉預處理的ALI小鼠BALF中TNF-α及IL-1β在1h、3h、6h、12h及24h的濃度均較ALI小鼠模型的顯著降低,存在顯著性差異(p<0.05)。ELISA法檢測經(jīng)丁酸鈉預處理的ALI小鼠肺組織勻漿液中MPO活性及NO濃度在1h、3h、6h、12h及24h較ALI小鼠模型的顯著降低,存在
9、顯著性差異(p<0.05)。經(jīng)丁酸鈉預處理的ALI小鼠肺濕干重比較ALI小鼠模型的明顯增高,存在顯著性差異(p<0.05)。經(jīng)丁酸鈉預處理的ALI小鼠肺組織的病理學改變較ALI小鼠的輕,尤其是炎性細胞的浸潤明顯減少。經(jīng)丁酸鈉預處理的ALI小鼠肺組織細胞核內(nèi)NF-κBp65的表達在1h、3h及6h較ALI的顯著降低,存在顯著性差異(p<0.05),而在12h和24h無顯著性差異(p﹥0.05);同時胞漿內(nèi)NF-κBp65的表達在3h和6h
10、較ALI的顯著增高,存在顯著性差異(p<0.05),而在1h、12h和24h無顯著性差異(p﹥0.05)。
結(jié)論
1.通過ELISA法檢測細胞上清液中炎性因子的濃度,發(fā)現(xiàn)丁酸鈉顯著抑制了LPS刺激后PBMC產(chǎn)生的TNF-α、IL-1β和IL-8,提示丁酸鈉體外抗炎作用可能主要依賴于其抑制炎性因子的產(chǎn)生。
2.通過檢測ALI小鼠模型BALF中TNF-α及IL-1β的濃度、肺組織勻漿液中MPO活性及NO濃度,觀
11、察肺組織濕干重比和病理學結(jié)果,表明LPS誘導的ALI小鼠模型的建立是成功的,為體內(nèi)試驗打下了基礎。
3.在ALI小鼠模型中,丁酸鈉預處理可以明顯降低小鼠TNF-α、IL-1β和NO的濃度,抑制MPO的活性,減輕肺水腫,改善肺組織病理學改變,說明丁酸鈉在ALI中起到保護作用。同時,發(fā)現(xiàn)丁酸鈉可以降低核內(nèi)NF-κB的表達,提示丁酸鈉可能通過抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)位,從而抑制炎性因子的釋放而發(fā)揮其抗炎作用的。
本研究從細胞水
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