丁酸鈉在急性肺損傷中保護(hù)作用與機(jī)制的研究.pdf

1、目的與背景
　　急性肺損傷是臨床上常見的急危重癥，目前仍缺少十分有效的治療措施。研究表明炎性細(xì)胞因子在急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后中具有重要的作用，抑制炎癥因子的產(chǎn)生可以有效的減輕急性肺損傷程度，而抗腫瘤藥物丁酸鈉已初顯其在抗炎方面的作用。本課題旨在研究丁酸鈉在體外及體內(nèi)的抗炎作用及其機(jī)制，為急性肺損傷的治療提供一種新的藥物。
　　材料與方法
　　1．采集健康人外周血，分離培養(yǎng)外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）。在培養(yǎng)PBMC

2、的培養(yǎng)基中分別加入一定濃度的脂多糖（LPS）和/或丁酸鈉，24小時(shí)后收集不同組別的細(xì)胞上清液。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β及IL-8的濃度，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析丁酸鈉是否抑制LPS刺激的PBMC炎性因子的產(chǎn)生。
　　2．Balb/c小鼠氣管內(nèi)滴入LPS（1mg/kg）構(gòu)建急性肺損傷（ALI）模型。構(gòu)建ALI模型后，獲取支氣管肺泡灌洗液（BALF），采用ELISA法檢測(cè)BALF中TNF-α及IL-1

3、β的濃度；取肺組織，分別測(cè)肺濕干重比、行病理組織切片檢查、ELISA法檢測(cè)組織勻漿液中MPO及NO濃度。通過上述數(shù)據(jù)分析ALI小鼠模型構(gòu)建成功與否。
　　3．在小鼠氣管內(nèi)滴入LPS之前1h，采用灌胃法給予小鼠丁酸鈉（10mg/kg）或生理鹽水預(yù)處理。于小鼠接受LPS刺激后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)獲取BALF，用ELISA法檢測(cè)BALF中TNF-α及IL-1β的濃度；獲取肺組織，分別測(cè)肺濕干重比、行病理組織切片檢查、ELISA法檢測(cè)組織勻漿液中

4、MPO及NO濃度、WesternBlot法檢測(cè)肺組織細(xì)胞核內(nèi)及胞漿核轉(zhuǎn)錄因子（NF）-κB的亞基NF-κBp65的表達(dá)情況。通過上述結(jié)果探討丁酸鈉在體內(nèi)的抗炎作用及機(jī)制。
　　研究結(jié)果
　　1．體外丁酸鈉的抗炎作用：PBMC在LPS刺激下TNF-α、IL-1β及IL-8均生成增多，分別達(dá)223.5±13.5pg/ml、106.2±10.6pg/ml和89.1±6.9pg/ml，均較空白對(duì)照及單純丁酸鈉處理組顯著增高，組間存在

5、顯著差異（p<0.05）。在給予LPS刺激前，預(yù)先行丁酸鈉預(yù)處理可以顯著抑制TNF-α、IL-1β及IL-8的產(chǎn)生，其濃度分別為130.9±10.4pg/ml、57.7±8.6pg/ml和48.6±5.5pg/ml，該組與空白對(duì)照及單純丁酸鈉組間存在顯著差異（p<0.05）。
　　2．ALI小鼠模型的建立：小鼠麻醉后，經(jīng)氣管滴入LPS（1mg/kg）構(gòu)建ALI小鼠模型。模型建立后3h，ELISA法檢測(cè)ALI小鼠BALF中TNF-α

6、及IL-1β的濃度分別為3678±16pg/ml和638±23pg/ml，空白對(duì)照組（氣管內(nèi)滴入生理鹽水）BALF中TNF-α及IL-1β的濃度分別為119±9pg/ml和46±6pg/ml，ALI小鼠模型BALF中炎性因子TNF-α及IL-1β濃度較空白對(duì)照組顯著增高，存在顯著性差異（p<0.05）。ELISA法檢測(cè)ALI小鼠肺組織勻漿液中MPO的活性及NO的濃度分別為44.2±2.3uIU/ml和92.8±2.4umol/L，空白對(duì)

7、照組肺組織勻漿液中MPO的活性及NO的濃度分別為5.5±0.8uIU/ml和5.0±0.8umol/L，ALI小鼠模型肺組織勻漿液中MPO活性及NO濃度較對(duì)照組顯著提高，存在顯著性差異（p<0.05）。ALI小鼠肺濕干重比為5.32±0.38，空白對(duì)照組肺濕干重比為4.22±0.23，ALI小鼠模型肺濕干重比較空白對(duì)照組明顯增高，存在顯著性差異（p<0.05）。ALI小鼠肺組織的病理學(xué)觀察：廣泛的肺泡壁水腫、增厚，肺泡內(nèi)出血，肺泡塌陷及

8、明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)?？瞻讓?duì)照組肺組織的病理學(xué)觀察表現(xiàn)為正常的肺組織病理學(xué)特點(diǎn)。
　　3．丁酸鈉體內(nèi)的抗炎作用及機(jī)制：ELISA法檢測(cè)經(jīng)丁酸鈉預(yù)處理的ALI小鼠BALF中TNF-α及IL-1β在1h、3h、6h、12h及24h的濃度均較ALI小鼠模型的顯著降低，存在顯著性差異（p<0.05）。ELISA法檢測(cè)經(jīng)丁酸鈉預(yù)處理的ALI小鼠肺組織勻漿液中MPO活性及NO濃度在1h、3h、6h、12h及24h較ALI小鼠模型的顯著降低，存在

9、顯著性差異（p<0.05）。經(jīng)丁酸鈉預(yù)處理的ALI小鼠肺濕干重比較ALI小鼠模型的明顯增高，存在顯著性差異（p<0.05）。經(jīng)丁酸鈉預(yù)處理的ALI小鼠肺組織的病理學(xué)改變較ALI小鼠的輕，尤其是炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)明顯減少。經(jīng)丁酸鈉預(yù)處理的ALI小鼠肺組織細(xì)胞核內(nèi)NF-κBp65的表達(dá)在1h、3h及6h較ALI的顯著降低，存在顯著性差異（p<0.05），而在12h和24h無顯著性差異（p﹥0.05）；同時(shí)胞漿內(nèi)NF-κBp65的表達(dá)在3h和6h

10、較ALI的顯著增高，存在顯著性差異（p<0.05），而在1h、12h和24h無顯著性差異（p﹥0.05）。
　　結(jié)論
　　1．通過ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中炎性因子的濃度，發(fā)現(xiàn)丁酸鈉顯著抑制了LPS刺激后PBMC產(chǎn)生的TNF-α、IL-1β和IL-8，提示丁酸鈉體外抗炎作用可能主要依賴于其抑制炎性因子的產(chǎn)生。
　　2．通過檢測(cè)ALI小鼠模型BALF中TNF-α及IL-1β的濃度、肺組織勻漿液中MPO活性及NO濃度，觀

11、察肺組織濕干重比和病理學(xué)結(jié)果，表明LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠模型的建立是成功的，為體內(nèi)試驗(yàn)打下了基礎(chǔ)。
　　3．在ALI小鼠模型中，丁酸鈉預(yù)處理可以明顯降低小鼠TNF-α、IL-1β和NO的濃度，抑制MPO的活性，減輕肺水腫，改善肺組織病理學(xué)改變，說明丁酸鈉在ALI中起到保護(hù)作用。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)丁酸鈉可以降低核內(nèi)NF-κB的表達(dá)，提示丁酸鈉可能通過抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)位，從而抑制炎性因子的釋放而發(fā)揮其抗炎作用的。
　　本研究從細(xì)胞水