遺傳性耳聾家系的基因定位及基因診斷研究.pdf

1、第一章：兩個(gè)Waardenburg綜合征Ⅳ型家系的臨床特征及相關(guān)基因突變研究
　　 目的：收集了兩個(gè)Waardenburg綜合征Ⅳ型家系(WS01家系和WS02家系)，擬對(duì)其進(jìn)行臨床診斷分析和基因突變檢測(cè)研究。
　　 方法：對(duì)兩個(gè)家系成員進(jìn)行了病史采集、臨床聽(tīng)力學(xué)分析及體格檢查，并進(jìn)行了Waardenburg綜合征Ⅳ型相關(guān)基因(EDNRB、EDN3、SOX10基因)的外顯子測(cè)序以篩查致病突變。
　　 結(jié)果：WS0

2、1家系一共兩代5人，先證者與其大姐分別為Waardenburg綜合征Ⅳ型和waardenburg綜合征Ⅱ型患者，兩位患者均表現(xiàn)為左眼虹膜異色，先證者伴有先天性巨結(jié)腸；WS02家系先證者為1歲女童，Waardenburg綜合征Ⅳ型患者，雙側(cè)虹膜異色，伴有先天性巨結(jié)腸。三位患者聽(tīng)力學(xué)檢查均提示雙耳極重度感音神經(jīng)性聾，眼底檢查呈現(xiàn)晚霞狀改變，無(wú)皮膚毛發(fā)顏色異常及內(nèi)眥移位。WS01家系的先證者及其大姐均檢測(cè)到有SOX10基因的2號(hào)外顯子上存在c

3、.254G>A(P.Trp85X)雜合突變，而先證者的母親(正常人)SOX10基因的2號(hào)外顯子上也檢測(cè)到有c.254G>A雜合突變，多次測(cè)序后發(fā)現(xiàn)突變峰的高度僅為正常峰高度的1/3；WS02家系的先證者SOX10基因的4號(hào)外顯子測(cè)序發(fā)現(xiàn)一個(gè)剪接位點(diǎn)的雜合突變c.698-2A>T，患者的父母未攜帶此突變。用直接測(cè)序法對(duì)100例不相關(guān)的正常人進(jìn)行SOX10基因突變c.254G>A和c.698-2A>T的檢測(cè)，結(jié)果沒(méi)有檢測(cè)到相同突變。

4、　　 結(jié)論：1.本研究所報(bào)道的waardenburg綜合征Ⅳ型病例屬國(guó)內(nèi)首次報(bào)道；2.SOX10基因突變位點(diǎn)c.254G>A(P.Trp85X)和c.698-2A>T屬于新發(fā)突變位點(diǎn)，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)此突變位點(diǎn)的報(bào)道；3.SOX10基因可能存在鑲嵌體。
　　 第二章：一個(gè)常染色體顯性遺傳性耳聾大家系的致病位點(diǎn)定位研究
　　 目的：為明確一來(lái)自湖南張家界地區(qū)非綜合征型常染色體顯性遺傳耳聾家系的基因診斷，對(duì)此家系進(jìn)行了初步的

5、定位及候選基因篩查工作。
　　 方法：收集了一4代人的常染色體顯性遺傳非綜合征型耳聾家系，家系中一共有41人，由于家系發(fā)病年齡在20-30歲左右，故將未到達(dá)發(fā)病年齡的家系成員排除在研究外。本研究共對(duì)家系中14名成員(其中包括7名患者和7名正常人)進(jìn)行了臨床診斷分析、遺傳基因定位及基因篩查研究。首先，根據(jù)家系耳聾患者的臨床表型及遺傳方式，對(duì)家系成員進(jìn)行了最常見(jiàn)的非綜合征型顯性耳聾基因COCH、EYA4、GJB2、GJB3基因的直接

6、測(cè)序排查及與家系表型相似的耳聾致病位點(diǎn)的排除定位分析。排除分析后應(yīng)用Illumina linkage芯片對(duì)該家系進(jìn)行了全基因組掃描以初步定位致病區(qū)間，在初步定位的區(qū)間內(nèi)挑選MARKER進(jìn)行精細(xì)定位。最后，對(duì)精細(xì)定位區(qū)間內(nèi)的已知耳聾基因進(jìn)行直接測(cè)序篩查家系致病突變。
　　 結(jié)果：家系臨床特征表現(xiàn)為：語(yǔ)后聾，20-30歲左右發(fā)病，發(fā)病初期表現(xiàn)為耳鳴及高頻聽(tīng)力下降，40歲左右進(jìn)行性發(fā)展為雙耳重至極重度聾。排除COCH、EYA4、GJB

7、2、GJB3基因及相關(guān)耳聾致病位點(diǎn)后進(jìn)行了全基因組掃描及微衛(wèi)星精細(xì)定位，經(jīng)過(guò)多點(diǎn)Lod值的計(jì)算及單體型分析最終將該家系的致病區(qū)間定位在chr1：P34.2-P34.3(D1S2656；D1S3721)約8.21cM的區(qū)間，在D1S2729和D1S2892marker得到了最大多點(diǎn)lod值3.1，此區(qū)間與已定位的DFNA2位點(diǎn)重疊，對(duì)DFNA2位點(diǎn)上兩個(gè)已克隆耳聾基因GJB3和KCNQ4進(jìn)行直接測(cè)序篩查后未發(fā)現(xiàn)與家系相關(guān)的致病突變。

8、>　　 結(jié)論：DFNA2位點(diǎn)上可能存在其他的基因參與該家系耳聾的發(fā)生。
　　 第三章：Il lumina Goldengate384k高通量耳聾基因篩查芯片的設(shè)計(jì)、研發(fā)及其對(duì)遺傳性耳聾家系的檢測(cè)
　　 目的：設(shè)計(jì)、制備Illumina Goldengate384K高通量耳聾基因篩查芯片，采用此芯片以期在更廣的范圍內(nèi)對(duì)已知耳聾突變位點(diǎn)進(jìn)行篩查和對(duì)耳聾大家系進(jìn)行己定位耳聾位點(diǎn)的排除定位。
　　 方法：芯片設(shè)計(jì)原則：

9、由于芯片的引物探針需間隔60bp以上才能確保準(zhǔn)確的雜交，故我們?cè)谡页鏊幸阎@相關(guān)突變位點(diǎn)的基礎(chǔ)上，首先挑選出目前文獻(xiàn)報(bào)道有2篇以上的突變位點(diǎn)，再依據(jù)60bp距離盡可能多的將剩余的突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)在芯片上，一共選取了240個(gè)耳聾相關(guān)突變位點(diǎn)，包括77個(gè)顯性突變位點(diǎn)及163個(gè)隱性突變位點(diǎn)。另外，我們?cè)趤喼奕巳褐袌?bào)道的己克隆耳聾相關(guān)基因中，選取了144個(gè)SNP位點(diǎn)，整張芯片共384個(gè)檢測(cè)點(diǎn)。該芯片可進(jìn)行已知耳聾相關(guān)突變位點(diǎn)的高通量篩查和耳聾相

10、關(guān)家系的初步排除定位。我們通過(guò)對(duì)465例DNA樣本進(jìn)行Illumina GoldenGate384K高通量耳聾基因芯片篩查，統(tǒng)計(jì)芯片Call rate、對(duì)其準(zhǔn)確性進(jìn)行了驗(yàn)證、對(duì)芯片中144個(gè)SNP位點(diǎn)的等位基因頻率進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析及對(duì)芯片的排除定位連鎖分析進(jìn)行了驗(yàn)證。對(duì)90個(gè)耳聾家系的135例DNA樣本的芯片檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。
　　 結(jié)果：1.芯片總的Call rate為96.32％，Call rate達(dá)到100％的位點(diǎn)有110個(gè)

11、；2.對(duì)芯片上的GJB2_235delC突變檢測(cè)點(diǎn)進(jìn)行了準(zhǔn)確性驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)芯片此檢測(cè)點(diǎn)的假陽(yáng)性率為3/97(3.1％)，假陰性率為0；3.芯片中有8個(gè)基因的19個(gè)SNP位點(diǎn)的最小等位基因頻率小于0.1(10％)；4.芯片對(duì)本研究中一耳聾家系的定位位置與傳統(tǒng)的微衛(wèi)星定位掃描定位的位置相同，認(rèn)為該芯片能較準(zhǔn)確的進(jìn)行耳聾相關(guān)基因的排除定位連鎖分析；5.在此次患者樣本檢測(cè)中共有12個(gè)基因的31個(gè)突變檢測(cè)位點(diǎn)在耳聾家系患者中有檢出，剩余有189個(gè)檢

12、測(cè)位點(diǎn)在此次檢測(cè)中無(wú)檢出。這189個(gè)耳聾突變位點(diǎn)在中國(guó)耳聾家系人群中則可能屬于罕見(jiàn)的突變位點(diǎn)。對(duì)90個(gè)耳聾家系的135例DNA樣本的芯片檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)GJB2_235delC、SLC26A4_IVS7-2A>G等突變位點(diǎn)與目前國(guó)內(nèi)報(bào)道的突變檢出率相似，PJVK_988delG(57.36％)、SLC26A4_Gly497Ser(7.14％)等既往報(bào)道中的非熱點(diǎn)突變?cè)诖舜味@家系患者中也具有很高的突變檢出率。
　　 結(jié)論：

13、研究所設(shè)計(jì)的高通量耳聾基因篩查芯片可以更廣范圍內(nèi)對(duì)一些不常檢測(cè)的耳聾相關(guān)突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)及可對(duì)耳聾家系進(jìn)行初步排除定位。PJVK_988delG(57.36％)、SLC26A4_Gly497Ser(7.14％)等既往報(bào)道中的非熱點(diǎn)突變?cè)诙@家系患者中具有很高的突變檢出率，其是否是多肽或是與檢測(cè)人群不同有關(guān)還是芯片檢測(cè)的準(zhǔn)確性問(wèn)題?我們將在下一步工作中對(duì)有檢出的突變位點(diǎn)進(jìn)行準(zhǔn)確性驗(yàn)證，并對(duì)芯片設(shè)計(jì)內(nèi)容進(jìn)行調(diào)整，剔除突變頻率較低、Call