腰椎間盤同種免疫的實(shí)驗(yàn)研究及其臨床法醫(yī)學(xué)意義.pdf

1、腰椎間盤突出(Lumbar disc herniation，LDH)是一種臨床常見病，亦有腰椎間盤纖維環(huán)破裂癥、腰椎間盤脫出癥、腰椎軟骨板破裂癥等稱謂。美國(guó)骨科醫(yī)師學(xué)會(huì)對(duì)椎間盤病變作了如下分類：椎間盤正常(椎間盤無退變，所有椎間盤組織均在椎間隙內(nèi))；椎間盤膨出(纖維環(huán)環(huán)狀均勻性超出椎間隙范圍，椎間盤組織沒有呈局限性突出)；椎間盤突出(椎間盤組織局限性移位超過椎間盤間隙)；椎間盤脫出(移位椎間盤組織的直徑大于基底連續(xù)部，并移向于椎間隙之外

2、)。在該癥的發(fā)病機(jī)制中，人的生理退變是其主導(dǎo)因素，之后才是外傷等原因。因此，在臨床法醫(yī)學(xué)鑒定工作中經(jīng)常涉及LDH的傷、病鑒別以及由此延伸的突出時(shí)間的推斷問題。鑒定過程中，由于當(dāng)事人的特殊心理作用，如何準(zhǔn)確推斷LDH的突出時(shí)間顯得尤為重要。既往研究顯示，CT、MRI等影像學(xué)以及電生理學(xué)技術(shù)都只能作為L(zhǎng)DH的診斷指標(biāo)，而無法準(zhǔn)確辨別腰椎間盤生理退變和LDH這一連續(xù)過程中的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，不能進(jìn)行LDH發(fā)生時(shí)間的準(zhǔn)確推斷。 臨床上，確診為L(zhǎng)D

3、H的患者，絕大多數(shù)都有一些由于腰椎間盤退行性病變導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)組成改變，致使髓核突出而產(chǎn)生的腰背痛、放射性痛等癥狀。關(guān)于LDH后如何引起疼痛，一直存在爭(zhēng)議。目前主要有自身免疫反應(yīng)學(xué)說和炎癥反應(yīng)學(xué)說的發(fā)展。 1965年，Bobechko等<'[1]>首次提出髓核組織具備自身抗原的基礎(chǔ)。這一學(xué)說不同于以往用于診斷LDH的影像學(xué)、電生理學(xué)指標(biāo)，此論點(diǎn)的關(guān)鍵在于椎間盤纖維環(huán)的破裂，髓核組織暴露給機(jī)體外周循環(huán)系統(tǒng)，產(chǎn)生自身免疫反應(yīng)。而纖維環(huán)破

4、裂恰恰是腰椎間盤退行性病變與LDH的這一連續(xù)過程的轉(zhuǎn)折點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過同種異體椎間盤髓核組織免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，制作了LDH髓核暴露給機(jī)體循環(huán)系統(tǒng)之后，動(dòng)物體液免疫發(fā)生異常的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，進(jìn)一步驗(yàn)證了LDH的免疫學(xué)說，并運(yùn)用敏感的間接ELISA方法對(duì)基礎(chǔ)免疫后動(dòng)物外周血中IgG、IgM的含量進(jìn)行了測(cè)定，探討推斷椎間盤突出時(shí)間的新方法。 材料與方法: 一、實(shí)驗(yàn)材料 (一)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年新西蘭大白兔50只(中國(guó)醫(yī)科大

5、學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部提供)，雄性，6個(gè)月齡，體重2.0-2.5Kg，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。 (二)主要試劑 弗氏完全佐劑，弗氏不完全佐劑(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)免疫教研室提供)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG、IgM(購(gòu)于北京中杉試劑有限公司)；小牛血清蛋白(北京博奧森試劑有限公司)。 (三)主要實(shí)驗(yàn)儀器 內(nèi)切式勻漿機(jī)，-70℃低溫冰箱；低溫高速離心機(jī)；洗滌用磁力震蕩器；PH檢測(cè)儀，酶標(biāo)板。 二、實(shí)驗(yàn)方法

6、 (一)動(dòng)物分組將實(shí)驗(yàn)新西蘭大白兔置于自然晝夜規(guī)律光照條件下，自由進(jìn)食、飲水，每籠4只，控制室溫于18～20℃。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，稱重。隨機(jī)分為四組：抗原制備組10只；生理鹽水對(duì)照組10只；佐劑對(duì)照組10只；實(shí)驗(yàn)組20只。 (二)抗原制備處死抗原制備組新西蘭大白兔，前路進(jìn)入，取出各節(jié)段椎間盤髓核組織，注意取材過程中勿將血液、肌肉、纖維環(huán)等雜質(zhì)混入。然后將組織4000r/min冰浴勻漿。4℃，6000r/min離心20m

7、in，取上清。分光光度計(jì)分別測(cè)定其A260、A280，運(yùn)用Lowry-Kalckar公式計(jì)算其蛋白質(zhì)濃度。-70℃分裝保存(1.0-2.0ml)。 (三)動(dòng)物免疫動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，取2.0mg/ml抗原20ml與等量弗氏完全佐劑(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)免疫教研室提供)乳化，對(duì)實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物進(jìn)行背部多點(diǎn)基礎(chǔ)免疫。此后每隔兩周進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫(采用弗氏不完全佐劑，抗原濃度10.0mg/ml)，共加強(qiáng)免疫3次。 (四)抗血清制備免疫前采

8、血一次所得血清即為每只兔免疫前之對(duì)照血清，此后每隔兩周于每只新西蘭大白兔耳緣靜脈采血4.0ml，室溫靜置1h，4℃過夜，10000r/min，10min，分離血清，于-20℃冰箱分裝保存，其余各組分別為不同時(shí)段相應(yīng)的免疫后血清，以抗體效價(jià)最佳者做為免疫后血清代表，測(cè)定抗體含量。 (五)間接ELISA法測(cè)血清中IgG、IgM的含量自制抗原包板，然后通過間接ELISA法用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔檢測(cè)自制抗血清中的抗體含量。

9、 (六)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 11.5對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 同種異體椎間盤髓核組織免疫組、自身對(duì)照組、佐劑對(duì)照組、生理鹽水對(duì)照組兔血清中IgG的含量分別為0.7566±0.1607(OD<,450>)、0.4936±0.0491(OD<,450>)、0.4690±0.0512(OD<,450>)、0.4339±0.0636(OD<,450>)。其中，免疫組與自身對(duì)照組相比，t=7.03，P<0.05

10、，兩組數(shù)據(jù)相比，有顯著性差異；免疫組與佐劑對(duì)照組以及生理鹽水對(duì)照組進(jìn)行方差分析，各組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，佐劑對(duì)照組與生理鹽水對(duì)照組相比，P=0.524，>0.05，兩組之間無顯著性差異；佐劑對(duì)照組與生理鹽水對(duì)照組分別與免疫組相比，P<0.05，有顯著性差異。免疫組、自身對(duì)照組、佐劑對(duì)照組、生理鹽水對(duì)照組兔血清中IgM的含量分別為0.0745±0.0139(OD<,150>)、0.0441±0.0046(OD<,450>)、0.0438±

11、0.0054(OD<,450>)、0.0426±0.0033(OD<,450>)。免疫組與自身對(duì)照組相比，t=9.254，P<0.05，有顯著性差異；免疫組與佐劑對(duì)照組以及生理鹽水對(duì)照組進(jìn)行方差分析，各組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，佐劑對(duì)照組與生理鹽水對(duì)照組相比，P=0.794，>0.05，兩組之間無顯著性差異；佐劑對(duì)照組與生理鹽水對(duì)照組分別與免疫組相比，P<0.05，有顯著性差異。 結(jié)論： 1、建立了一種新的用來證明LDH體液